Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

1. Raccolta, conservazione e preparazione dei liquidi di lavaggio broncoalveolare di siero e

1. Raccogliere siero da campioni di sangue non trattati consentendo coagulazione a 4 ° C, e siero negozio come aliquote a -20 ° C prima dell'uso. Liquidi di lavaggio broncoalveolare (BAL) dovrebbero essere memorizzati come aliquote a -20 ° C. Nota: Stoccaggio di siero e BAL come aliquote limita il potenziale di degradazione della antigene bersaglio da ripetuti di congelamento-scongelamento dei campioni durante la ripetizione del test.
2. Scongelare i campioni e mescolare i campioni di siero e BAL accuratamente su vortex e centrifugare per 1 min a 14.000 rpm.
3. Per le prove di routine di campioni di siero umano, diluire il siero 1:01 (v / v) con mezzo di coltura tissutale (TCM). TCM consiste di mezzo RPMI-1640, 10% (v / v) di siero fetale bovino, 1% (v / v) di 200 mM L-glutammina soluzione, e sodio azide (0,02% w / v) come conservante. Il terreno è preparato in anticipo e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi. Applicare 100 microlitri della diluted il siero LFD.
4. Per fluidi umani BAL, e per i fluidi di BAL modelli animali, si applicano 100 microlitri di campione puro al LFD, senza alcun pre-trattamento.
5. Per il siero da modelli animali, diluire siero 1:2 (v / v) con soluzione salina tamponata con fosfato contenente il 4% (w / v) EDTA, calore per 3 minuti in un bagno di acqua bollente, centrifugare per 5 min a 14.000 rpm, e applicare 100 ul di surnatante pulito al dispositivo LFD.

2. Applicazione di siero e BAL al dispositivo a flusso laterale

1. Conservare il flusso laterale dispositivi a temperatura ambiente (23 ° C). A questa temperatura, dispositivi sono stabili per 12 mesi. Rimuovere i dispositivi dalle loro tasche e posto su una superficie piana.
2. Utilizzando una punta di pipetta sterile, applicare 100 pl di pretrattato campione di siero o pulito BAL alla porta di uscita del dispositivo.
3. Lasciare il saggio a funzionare per 15 min a temperatura ambiente, momento in cui i risultati delle prove devono essere registrati. Nota: In pochi secondi il liquido sarà seen migrare per capillarità lungo la membrana di nitrocellulosa nella finestra di osservazione.

3. Registrazione ed interpretare i risultati LFD

1. La LFD consiste di una linea di controllo interno (indicato con la lettera C sul contenitore in plastica) e una linea di test (indicata con la lettera T). La linea di controllo deve sempre apparire a prescindere di antigene Aspergillus nel campione di siero o BAL. Questo dimostra che il test è stato eseguito correttamente.
2. Se l'antigene Aspergillus è presente nel campione di siero o BAL, la linea di test appariranno anche entro 15 minuti di applicazione del campione. Poiché l'intensità della linea di test è proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione Aspergillus, la linea di test può apparire come una debole positivo (+), un moderato positivo (+ +) o come un forte positivo (+ + +) . Tuttavia, qualsiasi linea test positivo, indipendentemente intensità, che indicano la presenza di Aspergillus antigene nel campione. In the l'assenza di antigene Aspergillus, nessuna linea di test apparirà, e il risultato è registrato come negativo (-).

4. Risultati rappresentativi

Esempi rappresentativi di negativo, debolmente positivi, moderatamente positivi risultati positivi, e forte LFD con campioni di BAL e siero sono mostrati nella Figura 1.

I risultati di antigene prove positive di LFD (debole e forte) o negativi test LFD che utilizza fluidi BAL da leucemia mieloide acuta (AML) pazienti diagnosticati secondo EORTC / MSG criteri diagnostici sono riportati nella Tabella 1. Incluso in questa tabella sono i corrispondenti clinici e micologica (galattomannano e cultura) i dati ei risultati di un test specifico Aspergillus-PCR sviluppato presso Ospedale S. Bartolomeo ^8, per ogni paziente. La diagnosi della malattia è basata su fattori dell'ospite (neutropenia, l'uso prolungato di corticosteroidi, il trattamento con altri riconosciuti cellule T immunosuppressants), i criteri clinici e positività GM per il BAL (qui definito come un valore di indice GM> 0,8). Sotto i 2002 EORTC / MSG linee ^10, 12 pazienti, 13 e 16 sono stati diagnosticati con IA 'possibile' sulla base di fattori dell'ospite e dei criteri clinici o positività GM. Secondo le riviste (2008) EORTC / MSG linee ^2, i fattori di accoglienza e positività GM da soli o host fattori e dei criteri clinici da soli non indicherebbe l'infezione 'possibile' fungina invasiva se non accompagnati da documenti giustificativi da dati clinici e micologia, rispettivamente. Paziente 6 è stato diagnosticato un IA 'probabile' in entrambi i 2002 e il 2008 le linee guida a causa di fattori dell'ospite, le caratteristiche cliniche principali e secondarie e positività GM. Si noti che, mentre né il LFD né saggi di PCR sono attualmente inclusi nelle linee guida EORTC / MSG, esiste un accordo forte tra i due test e il test commerciale galattomannano che indicano la presenza di antigeni di Aspergillus e di acido nucleico nel campione BAL s di pazienti 6 e 12. Ulteriori risultati delle prove dimostrano l'efficacia dei saggi PCR LFD e nella diagnosi di IPA si possono trovare in Johnson et al ^8.

Figura 1. Negativo (linea di controllo solo) e positivo (linea di controllo e di prova) i risultati delle prove LFD utilizzando siero e nel BAL. Le intensità di reazioni di linea dei test sono proporzionali alle concentrazioni dell'antigene bersaglio nei campioni di siero e BAL. Le reazioni in genere varia da debole (+) attraverso moderata (+ +) a forte (+ + +). Indipendentemente intensità prova linea, tutte tre le reazioni di siero positivi indicherebbe invasiva aspergillosi malattia polmonare dovuta alla presenza di antigene Aspergillus circolante nel sangue. Positive le reazioni BAL (debole, moderata o forte) sta ad indicare la germinazione delle spore e lo sviluppo di ife potenzialmente patogeni nei polmoni.

¹ noduli o aloni su una tomografia computerizzata di scansione è suggestivo di infezione fungina
² Candida glabrata nel BAL verrebbe considerato come contaminante in quanto è la seconda più comune lievito isolato come parte della normale flora umani ^9
3 Un indice di> 0,8 nel test GM VIA del BAL è indicativa di infezione da Aspergillus
⁴ Sulla base dei 2002 EORTC / MSG criteri diagnostici per la 'possible ',' probabilmente 'o' provata 'malattia fungina invasiva ^10
5 Sulla base delle riviste (2008) EORTC / MSG criteri diagnostici per la 'possibile', 'probabile' o 'provata' la malattia fungina invasiva ²

Tabella 1. Risultati delle prove LFD di campioni di BAL da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta con IPA probabile e dal controllo di pazienti con LMA (nessuna evidenza di infezione), e EORTC / MSG diagnosi di infezione.

Non abbiamo nulla da rivelare.