Noi descriviamo un protocollo di metodo per la GC-analisi, basata su strumenti derivati di acetato di aldonitrile di glucosamina e acido muramico estratti dal suolo. Per chiarire il meccanismo chimico, si presentano anche una strategia per confermare la struttura del derivato ed i frammenti di ioni formate sulla ionizzazione elettronica.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
GC-based Detection di acetato derivatizzata Glucosamina e muramico Acid Aldononitrile per la determinazione dei residui microbica nel terreno
In questo articolo
Sommario
Abstract
Quantitavo dei microrganismi che caratterizzano sono essenziali per una comprensione più ampia dello stato microbica e la funzione all'interno degli ecosistemi. Attuali strategie per l'analisi microbiologica di laboratorio tradizionali comprendono sia la cultura-dipendenti tecniche e quelle basate su estrazione diretta e la determinazione di alcuni biomarcatori 1, 2. Pochi tra la diversità delle specie microbiche abitano suolo possono essere coltivate, in modo da cultura-dipendenti metodi introdurre distorsioni significative, una limitazione assente nelle analisi di biomarker.
L'acido glucosamina, mannosammina, galattosamina e muramico sono stati ben servito come misure sia i vivi ei morti di massa microbica, di questi l'acido della glucosamina (più abbondante) e muramico (unicamente dalla cellula batterica) sono costituenti più importanti nei sistemi suolo 3 , 4. Tuttavia, la mancanza di conoscenza sulle analisi limita la divulgazione a livello scientifico tra pari. Tra tutti existing metodi analitici, derivatizzazione di aldononitrile acetati seguita da GC-based analisi è emerso come una buona opzione rispetto a bilanciare in modo ottimale precisione, sensibilità, semplicità, buona separazione cromatografica, e la stabilità durante lo stoccaggio del campione 5.
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per un'analisi affidabile e relativamente semplice di glucosamina e acido muramico dal terreno dopo la loro conversione al acetati aldononitrile. Il protocollo comprende principalmente quattro fasi: digestione acida, purificazione del campione, derivatizzazione e determinazione GC. Il passo-passo procedura viene modificato secondo ex pubblicazioni 6, 7. Inoltre, presentiamo una strategia per convalidare strutturalmente lo ione molecolare del derivato e suoi frammenti ionici formato sulla ionizzazione elettronica. Abbiamo applicato GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS e reagenti marcati con isotopi per determinare il peso molecolare di acetato glucosamina aldononitrile derivatizzata e murL'acido Amic, abbiamo usato lo spostamento di massa di isotopi marcati derivati nello spettro di ioni di indagare frammenti di ioni di ogni derivati 8. Oltre alla spiegazione teorica, la convalida di ione molecolare del derivato e suoi frammenti ionici sarà utile per ricercatori utilizzando δ 13 C o frammenti ionici di questi marcatori in studi biogeochimici 9, 10.
Protocollo
1. Preparazione del campione e l'estrazione degli acidi
- Liofilizzare campioni di terreno dopo la raccolta campo.
- Macinare e omogeneizzare campioni di suolo mediante un mulino a sfere, smerigliatrice suolo, o un mortaio e pestello.
- Pesare campioni di suolo (contenente> 0,3 mg N) in un pallone da 25 mL idrolisi.
- Aggiungere 10 ml di HCl 6M in ogni pallone idrolisi, compilare N 2 gas nei fiaschi, e tappo.
- Idrolizzano a 105 ° C in un incubatore per 8 ore utilizzando un timer automatico.
2. Purificazione del campione
- Rimuovere i palloni dall 'incubatrice; raf....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il presentato GC-based metodo per l'analisi di acetato derivatizzata glucosammina e acido muramico aldononitrile fornisce un metodo relativamente rapido per quantificare questi amminoacidi, zuccheri estratti dal suolo. I derivati sono chimicamente stabili, e può essere determinata in analisi. Il metodo non è limitato a campioni di terreno, e può essere semplificata per campioni di suolo non-matrice.
La pompa a vuoto utilizzata in questo metodo è costruito per essere resistenti agli aci.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti DOE Bioenergy Great Lakes Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). Siamo grati al Dr. Zhang Xudong membri del gruppo e dei suoi utili per le discussioni tecniche e commenti preziosi sulla messa a punto del protocollo.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| L'acido muramico | Sigma-Aldrich | M2503-25mg | |
| D-(+)-glucosammina cloridrato | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-metil-D-glucammina | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositolo | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Metanolo (secco) | Acros organici | AC326950010 | |
| 4-dimetilammino-piridina | Acros organici | AC148270050 | |
| Acetato di etile | VWR International | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine cloridrato | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Anidride acetica | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Diclorometano (cloruro di metilene) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Esano | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Acido cloridrico (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Idrossilammina cloridrato -15 N | Icona servizi | IN5280 | |
| Anidride acetica -2 H (D 6 C 4 O 3) | Acros organici | AC174670050 | |
| D-glucosio-U -13 C | Cambridge isotopo lab | CLM-1396-1 | |
| Ammonio sufate -15 N | Cambridge isotopo lab | NLM-713-1 | |
| Nome dell'apparecchiatura | Azienda | Tipo | |
| Rapid-Vap | Labconco | 790002 | |
| Vacum pompa | KNF Neuberger | D-79.112 | |
| Idrolisi pallone | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatizzazione microprovetta | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | Un Agilent 1200 Series HPLC accoppiato ad un LC Agilent / MSD-TOF |
Riferimenti
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
