Il protocollo cultura espianto di fibroblasti da biopsie cutanee umane è un modo tecnicamente robusto e semplice per ricavare cellule della pelle all'interno di 4-8 settimane per il settore bancario di circa 15-20 milioni di cellule in un numero basso passaggio.
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Articolo metodologico
Pelle Punch Biopsia Espianto Cultura per la derivazione di fibroblasti umani primari
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tessuti e linee cellulari derivate da un individuo con malattia sono fonti ideali per studiare fenotipi cellulari correlate alla malattia. Fibroblasti derivati da pazienti in questo protocollo sono stati utilizzati con successo nella derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte alla malattia modello 1. Primi passi di questi fibroblasti possono anche essere utilizzati per saggi funzionali a base di cellule per studiare percorsi specifici di malattia, meccanismi 2 e successive approcci di screening di stupefacenti. Il vantaggio del protocollo presentato nel corso procedure enzimatiche sono 1) la riproducibilità della tecnica di piccole quantità di tessuti derivati da pazienti anziani, ad esempio, pazienti affetti da morbo di Parkinson, 2) l'approccio tecnicamente semplice su metodologie più impegnativi utilizzando trattamenti enzimatici, e 3 ) il corrispettivo tempo: questo protocollo richiede 15-20 minuti e può essere eseguita subito dopo la biopsia arrivo. Trattamenti enzimatici possono richiedere fino a 4 ore e hanno i problemi dioverdigestion, riduzione della vitalità cellulare e la successiva collocazione delle cellule quando non gestita correttamente. Questo protocollo descrive la dissezione e la preparazione di una pelle umana 4 mm per biopsia derivazione di una coltura di fibroblasti e ha un tasso di successo molto alto che è importante quando si tratta di campioni di tessuti derivati da pazienti. In questa cultura, cheratinociti migrano fuori dal tessuto biopsia entro la prima settimana dopo la preparazione. I fibroblasti compaiono 7-10 giorni dopo la prima conseguenza di cheratinociti. DMEM High Media glucosio addizionato con 20% FBS favorisce la crescita dei fibroblasti su cheratinociti e fibroblasti sarà invadere i cheratinociti. Dopo 2 passaggi cheratinociti sono stati diluiti in colture di fibroblasti con conseguente relativamente omogenei che esprime la fibroblasti marcatore SERPINH1 (HSP-47). Usando questo approccio, 15-20 milioni fibroblasti possono essere derivate in 4-8 settimane per la raccolta di cellule. La dissezione pelle dura circa 15-20 minuti, le cellule vengono poi monitorati una volta al giornosotto il microscopio, e dei media è cambiata ogni 2-3 giorni dopo il sequestro e la conseguenza di cellule.
Protocollo
La pelle biopsia ottenuta utilizzando procedura standard 3 (ad esempio ottenuto con 4 millimetri strumento Visipunch rotondo) dovrebbe essere tenuto in completo DMEM 20% FBS media su ghiaccio. Una volta che il campione è arrivato in laboratorio, elaborare la biopsia appena possibile.
1. Preparazione della pelle Punch Biopsia
PASSI 1,1-1,3 DEVONO essere effettuata in un BIOSAFETY ARMADIO
- Preparare in anticipo: Aggiungere 1 ml di 0,1% di gelatina a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Impostare la piastra da parte per 30-60 min. Aspirare la soluzione di g....
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Risultati
Cheratinociti crescere senza i pezzi bioptici appena 48 ore dopo la dissezione. Prima fibroblasti escrescenza può essere osservato circa una settimana dopo l'elaborazione. Una volta che i pozzi hanno raggiunto confluenza, i fibroblasti sono diversi passaggi per altri due passaggi per raggiungere tre 150 centimetri palloni (T150) e le cellule vengono crioconservati. Noi generiamo con questo metodo di 15-20 milioni cellule. I fibroblasti sono positivi per anti-SERPINH1 (noto anche come HSP-47) (Figura 1),
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Discussione
Con questo protocollo, le culture relativamente pure di fibroblasti cutanei possono essere ottenuti. I fibroblasti hanno peculiari caratteristiche morfologiche, corpi cellulari mandrino-come allungate, rotonde a nuclei delle cellule ovali, ed i fibroblasti crescono allineati e in fasci, quando confluenti. I mezzi di comunicazione supporta la crescita dei fibroblasti, mentre altre popolazioni cellulari ad esempio cheratinociti bisogno supplementi e fattori di crescita, o sono mitoticamente meno attivi, ciò perme.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo sviluppo di questo protocollo è stato finanziato dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) e Parkinson Alliance.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio stereoscopico | Leica | S6E | |
| Piatto di Petri per coltura di tessuti da 10 cm | VWR | 25382-166 | |
| Piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti | VWR | 73520-906 | |
| Lame sterili monouso in acciaio inossidabile (2), lama n. 15, Miltex | VWR | 21909-660 | |
| Pinzette sterili con punta arrotondata | |||
| Tubi conici da 50 mL | VWR | 21008-940 | |
| Pipette sierologiche da 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Pipette sierologiche da 5 mL | VWR | 89130-896 | |
| Pipette sierologiche da 10 mL | VWR | 89130-898 | |
| Pipette di Pasteur | VWR | 14672-380 | |
| Tabella A. Tabella dei reagenti e delle attrezzature specifiche. | |||
| DMEM 1X: glucosio ad alta concentrazione | Invitrogen/Gibco | 11960-069 | |
| 20% siero fetale bovino | Invitrogen/Gibco | 26140-079 | |
| 1X L-glutammina | Invitrogen/Gibco | 25030-164 | |
| 1X MEM Aminoacidi non essenziali | Invitrogen/Gibco | 11140-076 | |
| 1X Penicillina/Streptomicina | Invitrogen/Gibco | 15140-163 | |
| Tabella B. Reagenti. |
Riferimenti
- Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B.
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Ristampe e permessi
