Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l'identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Sommario

Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

Abstract

Questo protocollo descrive un microscopio a fluorescenza basato su uno screening di piantine di Arabidopsis e descrive come mappare le mutazioni recessive che alterano la distribuzione subcellulare di uno specifico tag marker fluorescente in via secretoria. Arabidopsis è un potente modello biologico per gli studi genetici a causa della sua dimensione del genoma, tempo di generazione, e la conservazione dei meccanismi molecolari tra i regni. La matrice genotipizzazione come un approccio per mappare la mutazione in alternativa al metodo tradizionale basato su marcatori molecolari è vantaggiosa poiché è relativamente veloce e può consentire la mappatura dei diversi mutanti in un lasso di tempo molto breve. Questo metodo consente l'identificazione di proteine ​​che possono influenzare l'integrità di eventuali organello nelle piante. Qui, come esempio, si propone una schermata per mappare geni importanti per l'integrità del reticolo endoplasmatico (ER). Il nostro approccio, tuttavia, può essere facilmente estesa ad altri organelli cellulari vegetali(Si veda per esempio ^1,2), e rappresenta quindi un passo importante verso la comprensione delle basi molecolari che regolano le altre strutture subcellulari.

Protocollo

1. EMS Trattamento

Semi di Arabidopsis thaliana sono mutagenizzato utilizzando come agente mutageno metano solfonato di etile (EMS) ^3,4, che induce nelle C-to-T genoma cambi derivanti in C / G a T / A mutazioni ^5-7.

1. Pesare 0,8 g di semi di Arabidopsis (circa 40.000 semi) che trasportano il marcatore fluorescente organello (specificamente, in questo studio ssGFPHDEL (sequenza segnale-GFP-HDEL tetrapeptide) è stato usato come marcatore ER).
2. Trasferire i semi in un tubo da 50 ml Falcon, poi aggiungere 25 ml di acqua distillata.
3. Aggiungere 0,2% (v / v) metano solfonato etile.
....

Discussione

Qui descritto un microscopio confocale a base di screening per l'identificazione dei mutanti endomembrane. Questo approccio può essere facilmente estesa ad altri organelli della cella per cui specifici marcatori proteici fluorescenti sono disponibili. Lo schermo si basa sulla individuazione di mutanti che mostrano una distribuzione aberrante del marcatore fluorescente o in organello bersaglio o organelli che non dovrebbero contenere il marcatore. Rispettivamente, questi mutanti rappresentano popolazioni in cui è com.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Ethylmethane solfonato	Sigma	M0880
NaOH	JT Baker	3722-05
Murashige Skoog basali medi w Gamborg vitamine	Phyto technolog labor	M404
Phytagel	Sigma	P8169-1Kg
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Maestro vegetale puro foglia DNA kit di purificazione	Epicentre	MPP92100
Bioprime DNA sistema di etichettatura	Invitrogen	18094-011
Alcohol 200 prove	Decan laboratori inc.	2716
NaOAc	JT Baker
Gene Chip ATH1 Arabidopsisarray di genoma	Affymetrix	900385
Provette Falcon 50 mL	corning	430290
Provette Eppendorf 1,5 mL
Carta da filtro 90 millimetri	Whatman	1001090
Bilancia analitica	Mettler Toledo AB54-S	na
Contalitri volumetrico (wave) shaker	Heidolph Polymax 1040	na
Centrifuga	Eppendorf 5417-R	na