Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Summary

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per migliorare l'efficienza del differenziamento in vitro delle cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Le cellule staminali differenziate acquisito motoneuroni presenta come evidenziato dalla espressione di marcatori neuronali e motorie dei neuroni che utilizzano tecniche immunoistochimiche.

Abstract

Differenziazione diretta delle staminali embrionali (ES) in cellule funzionali motoneuroni rappresenta una risorsa promettente per studiare i meccanismi della malattia, per lo screening di nuovi composti farmacologici, e per sviluppare nuove terapie per malattie del motoneurone come l'atrofia muscolare spinale (SMA) e la sclerosi laterale amiotrofica ( ALS). Molti attuali protocolli utilizzano una combinazione di acido retinoico (RA) e sonic hedgehog (Shh) per differenziare staminali embrionali di topo (MES), le cellule in neuroni motori ^1-4. Tuttavia, l'efficienza differenziazione delle cellule SEM nel motore neuroni ha soltanto incontrato con discreto successo. Abbiamo sviluppato un protocollo due fasi differenziazione ⁵ che migliora significativamente l'efficienza di differenziazione rispetto a protocolli attualmente applicate. Il primo passo è di migliorare il processo neuralization aggiungendo Noggin e fattori di crescita dei fibroblasti (FGF). Noggin è una proteina morfogenetica dell'osso (BMP), antagonista ed è implicato in uno induzione neuraleecondo al modello predefinito di neurogenesi e risulta nella formazione di anteriore patterning neurale ^6. FGF segnalazione agisce sinergicamente con Noggin nell'indurre la formazione di tessuto neurale attraverso la promozione di una identità neurale posteriore ^7-9. In questa fase, le cellule sono state MES innescato con Noggin, bFGF, e FGF-8 per due giorni per promuovere la differenziazione verso lignaggi neurali. Il secondo passo è quello di indurre le specifiche dei neuroni motori. Noggin / FGFs esposti MES cellule sono state incubate con RA e un agonista Shh, agonista Smoothened (SAG), per altri 5 giorni per facilitare la generazione dei neuroni motori. Per monitorare la differenziazione di MES in neuroni motori, abbiamo utilizzato una linea di cellule ES derivata da un topo transgenico che esprime eGFP sotto il controllo del promotore motore neurone specifico HB9 ^1. Usando questo protocollo robusto, abbiamo raggiunto 51 ± 0,8% di efficienza differenziazione (n = 3; p <0,01, t di Student-test) ^5. I risultati di immunofluorescenzacolorazione ha dimostrato che le cellule GFP + esprimere i marcatori dei motoneuroni specifici, Islet-1 e colina acetiltransferasi (Chat). I nostri due fasi protocollo di differenziazione offre un modo efficace per differenziare le cellule MES in neuroni motori spinali.

Protocol

1. Fase 1: Mouse Embryonic Stem (MES) Cultura Cell (Timing: 3 giorni)

1. Placcatura fibroblasti primari embrionali di topo (PMEF)

1. Cappotto quattro da 100 mm di coltura dei tessuti piatti con gelatina di adesione PMEF. Aggiungere 8 ml di 0,1% soluzione di gelatina (StemCell Technologies) per ogni piatto e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
2. Togliere l'eccesso di gelatina da piatti. Non sciacquare i piatti.
3. Diluire una fiala di Mitomicina C-inattivato PMEF (Millipore) che contiene ca. 5 x 10 ⁶ cellule in 40 ml di PMEF supporti (vedi ricetta in tabella 1) e la piastra su quattro piatti tessuto 100-mm di coltura. Il PMEF fornire uno strato di alimentazione per le cellule MES.
4. PMEF devono essere seminati almeno un giorno prima di aggiungere colture cellulari MES. PMEF può essere usato fino a 1 settimana dopo la placcatura.

2. Placcatura MES Celle

Per monitorare l'efficienza della differenziazione cellulare MES in motoneuroni, Abbiamo utilizzato HBG3, una linea di cellule ES derivata da un topo transgenico che esprime eGFP sotto il controllo del promotore motore HB9 neurone specifico.

1. Sbrinamento 1 flacone di HBG3 cellule MES (circa 1 x 10 ^7, ha contribuito dal dottor Douglas Kerr, Johns Hopkins University) in un bagno di acqua a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di ES supporti (vedi ricetta in tabella 1) in una provetta da 15 ml e centrifugare le cellule a 800 rpm per 5 min.
2. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in MES 20 ml di supporto ES con fresco aggiunto fattore inibitorio della leucemia (LIF) ad una concentrazione finale di 10 ng / ml. NOTA: LIF deve essere aggiunto il giorno di utilizzo ed è necessario per mantenere le cellule MES uno stato indifferenziato.
3. Rimuovere 10 ml supporti PMEF dal PMEF in ogni piatto e aggiungere 10 ml di sospensione HBG3 cellule ES ad ogni piatto.
4. 24 h dopo la placcatura, cellule MES formano colonie piccole di dimensioni simili a colonia indicata dalla freccia in figura 1B. 72 h dopo la placcatura, colonies aumento delle dimensioni, molti essendo circa 100 micron di diametro (figura 1B, indicato dalle frecce). Queste cellule sono pronte per la differenziazione. I terreni devono essere sostituiti ogni giorno per mantenere la proliferazione delle cellule.

2. Fase 2: induzione neurale (Timing: 2 giorni)

Per indurre la differenziazione di cellule SEM nel motoneuroni, cellule MES devono essere separati da PMEF e coltivato in un ambiente sospensione. Gelatina fiaschi rivestiti sono usati per separare PMEF dalle cellule MES.

1. Quando le colonie MES sono pronti per l'induzione neurale (definito come giorno differenziazione 0), mantello 2 fiasche T150 con gelatina 0,1% (18 ml / beuta) per 30 min a temperatura ambiente e quindi rimuovere gelatina eccesso e lavare con PBS 1X tre volte. NOTA: Ogni 100-mm cultura piatto sarà necessario uno T150-gelatina pallone rivestito per separare PMEF.
2. Rimuovere con attenzione dei media per aspirazione, facendo attenzione a non rimuovere le colonie vagamente collegati. Aggiungere 10 ml di PBS brevemente e quindi rimuovere per aspirazione per completare la fase di lavaggio.
3. Per separare le cellule MES di PMEF, aggiungere 0,25% di tripsina / EDTA (3 ml / piatto, StemCell Technologies) e incubare per 3-5 minuti a 37 ° C finché le cellule staminali e PMEF staccarsi dalla piastra. Aggiungere 15 ml supporti ES freschi senza LIF e le cellule pipettare su e giù per rompere colonie (circa 15-20 volte). Quindi, aggiungere a una gelatina rivestita 0,1% T150 pallone e incubare per 30 min a 37 ° C. Dopo l'incubazione, PMEF dovrebbe attaccarsi alla superficie gelificato mentre le cellule staminali embrionali dovrebbe essere galleggiare. Raccogliere le cellule galleggianti MES in una provetta da 50 ml.
4. Centrifugare a 800 rpm e risospendere le cellule in 10 ml di Medium differenziamento neurale (vedi ricetta in Tabella 1).
5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e poi piastra circa 2 x 10 ⁶ cellule MES su un piatto di 100-mm coltura batterica o sospensione. Queste piastre permettono la crescita di colture in sospensione e promuovere la formazione di corpi embrionali (EBS).
6. On differentiazione 1 giorno, le cellule MES formare piccoli aggregati fluttuanti (EBS) che sono visibili al microscopio ottico. Qualsiasi PMEF riporto allegare al piatto. Trasferire le cellule in sospensione e media in un tubo da 15 ml e centrifugare a bassa velocità (500 rpm) per 3 min. Aspirare i media con attenzione, aggiungere 10 ml di fresca Medio differenziamento neurale al pellet EBS, e poi le cellule piastra in un nuovo piatto batterica. Oltre a rifornire i mezzi di comunicazione, questo passaggio rimuove qualsiasi PMEF che riporto dalla fase precedente.
7. Il giorno 2 differenziazione, EBS sono pronti per essere indotto in neuroni motori.

3. Fase 3: Motor Neuron Specification (Timing: 5 giorni)

1. Il giorno 2 differenziazione, agitare il piatto della cultura e trasferire la media e EBs in una provetta da 15 ml. Lasciate EBs risolvere per gravità (~ 10 min) oppure mediante centrifugazione a bassa velocità (500 rpm) per 3 min.
2. Aspirare il terreno con cura e risospendere EBs in 10 ml di differenziazione Motor Neuron (MND), medio (vedi ricetta in
3. Il giorno 7 differenziazione, EBs dovrebbe essere di circa 150 a 200 micron in diametro e dovrebbe esprimere segnali forti GFP (figura 1C). Si tratta di EB sono pronti per essere dissociati e placcato su poly-DL-ornithine/laminin piatti rivestiti o coprioggetti.

4. Fase 4: Preparazione del Poly-DL-ornithine/laminin Coprivetrini rivestite (Timing: 2 giorni)

Due giorni prima dissociare EBS (cioè il giorno differenziazione 5), preparare coprioggetti poly-DL-ornithine/laminin-coated.

1. Luogo 12 mm coprioggetto rotondi (Warner Instruments) sul fondo di una piastra da 24 pozzetti. Sciogliere 25 mg di poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) in 25 ml sterile, acqua bidistillata (d ₂ H ₂ O) per ottenere una soluzione 10X fotografia (1 mg / ml). Al momento dell'uso, una diluizione 1/10 di poli-DL-ornitina con d ₂ H ₂ O per ottenere concentrazione di 100 ug / ml. Aggiungere 0,5 ml a ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti ed incubare a 4 ° C per il pernottamento.
2. Il giorno successivo (differenziazione giorno 6), aspirare poli-DL-ornitina e lasciare che le piastre di copertura e scivola aria secca in un cappuccio coltura tissutale. Risciacquare nei pozzetti della piastra con D ₂ H ₂ O tre volte. Lasciare asciugare all'aria per un'altra ora.
3. Sciogliere 1 mg del mouse laminina (Millipore) in 5 ml di freddo-freddo 1X PBS per rendere disponibile una soluzione 100x (200 mg / ml). Al momento dell'uso, fare diluizione 1/100 in ghiacciato-freddo 1X PBS (2 mg laminina / ml). Aggiungere 0,5 ml / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e incubare a 4 ° C per il pernottamento. Prima che le cellule di semina, laminina in eccesso deve essere rimosso e pozzi risciacquati con PBS 1X due volte. Copri possono essere memorizzati in MND mezzo (0,5 ml / pozzetto).

5. Fase 5: Allungamento Axon (Timing: 2 giorni)

1. Il giorno 7 differenziazione, raccogliere EBs in un tubo da 15 ml e permettono di risolvere EB (circa 3 minuti). Aspirare media e ri-suspend EBs in PBS. Lasciare EBS per insediarsi e poi aspirare PBS. Ripetere questa operazione 3 volte. Aggiungere 1 ml di Accumax (Millipore) per l'EBS, mescolare delicatamente e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Poi aspirare Accumax eccesso che copre il EBS.
2. Per dissociare EBS, aggiungere 3 ml di terreno MND. Pipettare su e giù per 20 volte usando un ml 1 micropipetta Eppendorf (blu punta) per interrompere EBS. Incubare per 2 min a temperatura ambiente. Trasferire sospensione cellulare in un tubo mm 12x75 con cellule filtro tappo (BD Falcon) per ottenere una sospensione di cellule singole. Ripetere questo passaggio dissociazione di ciuffi e le cellule rimanenti trattenuti dal filtro, in modo da arricchire la resa di singole cellule. La sospensione finale singola cellula sarà 6 ml.
3. Mescolare delicatamente questa sospensione singola cella e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Diluire le cellule nel mezzo MND (supplementato con 10 ng / ml di ciascun BDNF, GDNF, CNTF, e NT-3) ad una densità di 2x10 ⁵ cellule per ml. Aggiungere sospensione cellulare (0,5 ml / pozzetto) a 24-pozzetti contenenti pocoprioggetti ly-DL-ornithine/laminin rivestite (precedentemente preparato come descritto sopra). Le cellule differenziate si estendono neuriti a lungo dopo 2 giorni di coltura (Figura 1D).

6. Risultati rappresentativi

Figura 1A mostra il profilo del protocollo. Nel passaggio 1, le cellule sono coltivate in MES PMEF e integrato con LIF per prevenire differenziazione spontanea. In generale, indifferenziate colonie MES sono rotondi e compatti, e sono chiaramente definiti i bordi. Le colonie non sono in contatto tra loro. Tipicamente, le cellule MES dovrebbe essere diviso in un rapporto 1:4 ogni 2 ~ 3 giorni. Tuttavia, ciascuna linea singola cellula crescerà ad un tasso differente e il rapporto di divisione devono essere determinate empiricamente. Le frecce in figura 1B indicano l'aspetto tipico di cellule MES dopo coltura su uno strato alimentatore PMEF per 3 giorni. Queste colonie sono di grandi dimensioni (50-100 micron di diametro), ma mantengono ancora orlo tondo e definitos. In questa fase le colonie sono pronti per la differenziazione o sottocultura. Una punta di freccia in Figura 1B mostra una piccola colonia MES che solitamente si trova 24 h dopo la placcatura. Quattro giorni dopo la placcatura, le cellule diventano MES invaso. Essi mostrano un aspetto appiattito e la perdita di confini definiti, che indica che stanno cominciando a differenziare. Tali cellule non sono ottimali per la differenziazione nelle cellule neuronali.

Per differenziare le cellule MES in neuroni motori, le cellule MES bisogno di essere coltivata in condizioni di sospensione per permettere la formazione EB. Nel passaggio 2, cellule ES sono trasferite su una superficie di coltura senza uno strato alimentatore per promuovere la formazione EB. In questo passo, vengono incubate in mezzo differenziamento neurale supplementato con Noggin, bFGF, e FGF-8 per 2 giorni a cellule dirette ad lignaggio neurale. Piccola EBS può essere osservata al microscopio a giorno 1 di differenziazione. Dovrebbero essere galleggiare nel mezzo. Riporto PMEF si possono trovare anche al giorno 1di differenziazione e devono essere rimossi. Queste cellule batteriche aderiscono ai piatti in modo vengono eliminati quando EBS sono diversi passaggi ad un nuovo piatto batterica. Così, al giorno 2 di differenziazione, PMEF pochi o nessun va visto nel piatto di coltura. Al punto 3, ha continuato il trasferimento di EBS per nuovi piatti devono assicurare la rimozione di qualsiasi PMEF rimanente. EBS sono coltivate nella differenziazione dei motoneuroni (MND), i media integrati con RA e SAG per 5 giorni di differenziare le cellule in neuroni motori. Durante la coltura, EB continuano a crescere in dimensione e può essere visto ad occhio nudo al giorno differenziazione 3 ~ 4. Figura 1C mostra l'aspetto microscopico di differenziazione EBs il giorno 7. A differenza delle cellule indifferenziate, EBS mostrano una forte fluorescenza a causa di espressione di GFP. Si tratta di EBS sono differenziati in modo ottimale e sono pronti per la dissociazione. Citometria a flusso dimostrato che il 51% ± 0,8% delle cellule dal dissociato EBs era differenziate in cellule esprimenti GFP ^5. Al punto 5, della cultura della thEse motoneuroni in presenza di GDNF, CNTF, BDNF, NT3 e risultati in estensione di lunghe proiezioni assonale. figura 1D mostra la comparsa di cellule differenziate 2 giorni dopo placcatura di dissociata EBs. Nota neuriti lunghi si estendono dai corpi cellulari delle cellule placcati. Colorazione immunofluorescente mostra che le cellule GFP + esprimono il pan-marcatore neuronale (neurofilamento-catena media) e due motori marcatori neuronali specifici, (Islet-1 e colina acetiltransferasi, Figura 2).

Figura 1. Differenziazione di cellule SEM nel motoneuroni (immagine modificata da Wu et al. ^5). A) Schema di protocollo di differenziazione da cellule MES per i motoneuroni. B) le cellule indifferenziate MES formano colonie rotonde sulla parte superiore di uno strato di fibroblasti alimentatore. Hanno debole espressione GFP. C) le cellule MES sono state separate da strati feeder e culturosso a basso attaccamento piatti a formare EBS. Durante i primi due giorni del processo di differenziazione, le cellule sono state esposte a 50 ng / Noggin ml, 20 ng / ml bFGF, e 20 ng / ml FGF-8. Successivamente, sono state indotte a differenziarsi con 1 pM acido retinoico e 1 pM sonic SAG agonista hedgehog per 5 giorni. Differenziate le cellule MES ha espresso una forte fluorescenza GFP. D) Dopo 7 giorni di differenziazione, EBS erano dissociate e placcato su poly-DL-ornithine/laminin piastre rivestite. Le cellule differenziate esteso lunghi processi neurali dopo 2 giorni di coltura. Scala bar = 200 micron. MN = motoneurone. B, C e D sono immagini in campo chiaro e B ', C' e D 'sono corrispondenti immagini a fluorescenza.

Figura 2. Caratterizzazione di MES derivati ​​da cellule neuroni motori. Immunofluorescenza per catena neurofilamenti medio (NF-M, rosso), chat (rosso), e Islet-1 (rossa) è stata coincidente con GFP (green) exprESSIONE. DAPI (blu) è stato utilizzato per identificare i nuclei. Scala bar = 50 micron.

Discussion

La qualità di cellule MES è il parametro più critico per la produzione efficiente di neuroni motori. MES cellule devono essere coltivate in PMEF per prevenire differenziazione spontanea. L'aggiunta di LIF aiuta a mantenere le cellule MES uno stato indifferenziato. Come cellule MES dividere ogni 12-15 ore, il terreno di coltura si esaurisce rapidamente e deve essere sostituito ogni giorno.

Efficiente attivazione del pathway Shh è un parametro critico necessario per indurre motore neurone ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Concentrazione finale
PMEF	Millipore	PMEF-H	NA
PMEF media
DMEM	Invitrogen	11965-118	NA
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutammina	Invitrogen	25030-081	1%
Penicillina / streptomicina	Invitrogen	15240-063	1%
MES media
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES Cell-Qualified FBS	Invitrogen	16141-079	15%
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	1%
Aminoacidi non essenziali	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosidi	Millipore	ES-008-D	1%
β-mercaptoetanolo	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
Penicillina / streptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng / ml
Differenziazione medio Neural
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES Cult FBS	StemCell Technologies	06905	15%
Aminoacidi non essenziali	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-tio glicerolo	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Boccaletto	Invitrogen	PHC1506	50 ng / ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng / ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng / ml
MND medio (differenziazione)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	NA
Knockout sostituzione siero	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 integratore	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Acido ascorbico	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillina / streptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% in d 2 H 2 O
Fibronectina	StemCell Technologies	07159	5 pg / ml
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml in d 2 H 2 O
β-mercaptoetanolo	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
Acido Retinoico	Sigma-Aldrich	R-2625	1 pM
SAG	EMD Chemicals	566660	1 pM
MND medio (Motor Neuron cultura)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	NA
Knockout sostituzione siero	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 integratore	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Acido ascorbico	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillina / streptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% in d 2 H 2 O
Fibronectina	StemCell Technologies	07159	5 pg / ml
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml in d 2 H 2 O
β-mercaptoetanolo	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
BDNF	R & D Systems	248-BD-005/CF	10 ng / ml
CNTF	R & D Systems	257-NY-010/CF	10 ng / ml
GDNF	R & D Systems	212-GD-010/CF	10 ng / ml
NT-3	R & D Systems	267-N3-005/CF	10 ng / ml

<> Nome forte del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Concentrazione finale
0,1% gelatina	StemCell Technologies	07903	NA
Poly-DL-ornitina	Sigma-Aldrich	P0421	0,1 mg / ml in d 2 H 2 O
Mouse laminina	Millipore	CC095	2 ug / ml in PBS
0,25% di tripsina / EDTA	StemCell Technologies	07901	NA
Accumax	Millipore	SCR006	NA