Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Summary

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per migliorare l'efficienza del differenziamento in vitro delle cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Le cellule staminali differenziate acquisito motoneuroni presenta come evidenziato dalla espressione di marcatori neuronali e motorie dei neuroni che utilizzano tecniche immunoistochimiche.

Abstract

Differenziazione diretta delle staminali embrionali (ES) in cellule funzionali motoneuroni rappresenta una risorsa promettente per studiare i meccanismi della malattia, per lo screening di nuovi composti farmacologici, e per sviluppare nuove terapie per malattie del motoneurone come l'atrofia muscolare spinale (SMA) e la sclerosi laterale amiotrofica ( ALS). Molti attuali protocolli utilizzano una combinazione di acido retinoico (RA) e sonic hedgehog (Shh) per differenziare staminali embrionali di topo (MES), le cellule in neuroni motori ^1-4. Tuttavia, l'efficienza differenziazione delle cellule SEM nel motore neuroni ha soltanto incontrato con discreto successo. Abbiamo sviluppato un protocollo due fasi differenziazione ⁵ che migliora significativamente l'efficienza di differenziazione rispetto a protocolli attualmente applicate. Il primo passo è di migliorare il processo neuralization aggiungendo Noggin e fattori di crescita dei fibroblasti (FGF). Noggin è una proteina morfogenetica dell'osso (BMP), antagonista ed è implicato in uno induzione neuraleecondo al modello predefinito di neurogenesi e risulta nella formazione di anteriore patterning neurale ^6. FGF segnalazione agisce sinergicamente con Noggin nell'indurre la formazione di tessuto neurale attraverso la promozione di una identità neurale posteriore ^7-9. In questa fase, le cellule sono state MES innescato con Noggin, bFGF, e FGF-8 per due giorni per promuovere la differenziazione verso lignaggi neurali. Il secondo passo è quello di indurre le specifiche dei neuroni motori. Noggin / FGFs esposti MES cellule sono state incubate con RA e un agonista Shh, agonista Smoothened (SAG), per altri 5 giorni per facilitare la generazione dei neuroni motori. Per monitorare la differenziazione di MES in neuroni motori, abbiamo utilizzato una linea di cellule ES derivata da un topo transgenico che esprime eGFP sotto il controllo del promotore motore neurone specifico HB9 ^1. Usando questo protocollo robusto, abbiamo raggiunto 51 ± 0,8% di efficienza differenziazione (n = 3; p <0,01, t di Student-test) ^5. I risultati di immunofluorescenzacolorazione ha dimostrato che le cellule GFP + esprimere i marcatori dei motoneuroni specifici, Islet-1 e colina acetiltransferasi (Chat). I nostri due fasi protocollo di differenziazione offre un modo efficace per differenziare le cellule MES in neuroni motori spinali.

Protocol

1. Fase 1: Mouse Embryonic Stem (MES) Cultura Cell (Timing: 3 giorni)

1. Placcatura fibroblasti primari embrionali di topo (PMEF)

1. Cappotto quattro da 100 mm di coltura dei tessuti piatti con gelatina di adesione PMEF. Aggiungere 8 ml di 0,1% soluzione di gelatina (StemCell Technologies) per ogni piatto e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
2. Togliere l'eccesso di gelatina da piatti. Non sciacquare i piatti.
3. Diluire una fiala di Mitomicina C-inattivato PMEF (Millipore) che contiene ca. 5 x 10 ⁶ cellule in 40 ml di PMEF supporti (vedi ricetta in tabella 1) e la piastra su quattro....

Discussion

La qualità di cellule MES è il parametro più critico per la produzione efficiente di neuroni motori. MES cellule devono essere coltivate in PMEF per prevenire differenziazione spontanea. L'aggiunta di LIF aiuta a mantenere le cellule MES uno stato indifferenziato. Come cellule MES dividere ogni 12-15 ore, il terreno di coltura si esaurisce rapidamente e deve essere sostituito ogni giorno.

Efficiente attivazione del pathway Shh è un parametro critico necessario per indurre motore neurone .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Concentrazione finale
PMEF	Millipore	PMEF-H	NA
PMEF media
DMEM	Invitrogen	11965-118	NA
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutammina	Invitrogen	25030-081	1%
Penicillina / streptomicina	Invitrogen	15240-063	1%
MES media
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES Cell-Qualified FBS	Invitrogen	16141-079	15%
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	1%
Aminoacidi non essenziali	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosidi	Millipore	ES-008-D	1%
β-mercaptoetanolo	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
Penicillina / streptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng / ml
Differenziazione medio Neural
DMEM	StemCell Technologies	36250	NA
ES Cult FBS	StemCell Technologies	06905	15%
Aminoacidi non essenziali	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-tio glicerolo	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Boccaletto	Invitrogen	PHC1506	50 ng / ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng / ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng / ml
MND medio (differenziazione)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	NA
Knockout sostituzione siero	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 integratore	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Acido ascorbico	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillina / streptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% in d 2 H 2 O
Fibronectina	StemCell Technologies	07159	5 pg / ml
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml in d 2 H 2 O
β-mercaptoetanolo	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
Acido Retinoico	Sigma-Aldrich	R-2625	1 pM
SAG	EMD Chemicals	566660	1 pM
MND medio (Motor Neuron cultura)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	NA
Knockout sostituzione siero	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 integratore	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Acido ascorbico	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillina / streptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
-I Glutamax	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% in d 2 H 2 O
Fibronectina	StemCell Technologies	07159	5 pg / ml
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml in d 2 H 2 O
β-mercaptoetanolo	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
BDNF	R & D Systems	248-BD-005/CF	10 ng / ml
CNTF	R & D Systems	257-NY-010/CF	10 ng / ml
GDNF	R & D Systems	212-GD-010/CF	10 ng / ml
NT-3	R & D Systems	267-N3-005/CF	10 ng / ml

<> Nome forte del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Concentrazione finale
0,1% gelatina	StemCell Technologies	07903	NA
Poly-DL-ornitina	Sigma-Aldrich	P0421	0,1 mg / ml in d 2 H 2 O
Mouse laminina	Millipore	CC095	2 ug / ml in PBS
0,25% di tripsina / EDTA	StemCell Technologies	07901	NA
Accumax	Millipore	SCR006	NA