Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Sommario

Mycobacterium tuberculosis forma biofilm droga tolleranti, quando coltivate in determinate condizioni. Qui si descrivono i metodi per la coltura M. biofilm tubercolosi e che determinano la frequenza di persistenti droga tolleranti. Questi protocolli saranno utili per ulteriori studi sui meccanismi di tolleranza al farmaco in M. tubercolosi.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi umana, ha una straordinaria capacità di sopravvivere contro gli stress ambientali, compresi gli antibiotici. Sebbene la tolleranza allo stress di M. la tubercolosi è uno dei contributori probabili a 6 mesi di chemioterapia lunga serie di tubercolosi ^1, i meccanismi molecolari alla base di questo fenotipo caratteristico del patogeno rimangono poco chiari. Molte specie microbiche sono evoluti per sopravvivere in ambienti stressanti con l'auto-assemblaggio in altamente organizzato, superficie attaccata, e matrice di strutture incapsulate chiamata biofilm ^2-4. La crescita nelle comunità sembra essere una strategia di sopravvivenza preferito di microbi, e si ottiene attraverso componenti genetiche che regolano la superficie di applicazione, le comunicazioni intercellulari, e la sintesi di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) ^5,6. La tolleranza allo stress ambientale è probabilmente facilitata da EPS, e forse dal fisiologicoadattamento gico di bacilli individuale microambienti eterogenei all'interno della complessa architettura dei biofilm ^7.

In una serie di lavori recenti abbiamo stabilito che M. smegmatis Mycobacterium tuberculosis e hanno una forte propensione a crescere in strutture organizzate pluricellulari, chiamata biofilm, che può tollerare più di 50 volte le concentrazioni minime inibenti dei farmaci antitubercolari isoniazide e rifampicina ^8-10. M. la tubercolosi, però, richiede intrigante condizioni specifiche per formare biofilm maturi, in particolare il rapporto di 9:01: spazio di testa dei media così come limitato scambio d'aria con l'atmosfera ^9. Requisiti di specializzati condizioni ambientali potrebbe essere legato al fatto che M. la tubercolosi è un patogeno obbligato umana e quindi si è adattata agli ambienti dei tessuti. In questa pubblicazione si dimostra metodi di coltura M. tubercolosibiofilm in una bottiglia e un 12-pozzetti piastra, che è conveniente per studi batteriologici nonché genetica. Abbiamo descritto il protocollo per un ceppo attenuato di M. la tubercolosi, mc ² 7000, con l'eliminazione nei due loci, i panCD e RD1, che sono fondamentali per la crescita del patogeno vivo ^9. Questo ceppo può essere tranquillamente utilizzato in un BSL-2 di contenimento per la comprensione della biologia di base del patogeno della tubercolosi evitando così l'esigenza di un costoso impianto di BSL-3. Il metodo può essere esteso, con le opportune modifiche in media, a crescere biofilm di altre specie coltivabili micobatteri.

Nel complesso, un protocollo uniforme di biofilm coltura dei micobatteri aiuterà i ricercatori interessati a studiare le caratteristiche di base di micobatteri resistenti. Inoltre, un metodo chiaro e conciso di biofilm che crescono micobatteriche aiuterà anche i inv clinico e farmaceuticoestigators per testare l'efficacia di un potenziale farmaco.

Protocollo

1. Biofilm crescente di M. tubercolosi in una bottiglia con tappo a vite 250mL

1. Preparazione Media: sciogliere 0,5 g di KH ₂ PO _4, 0,5 g di MgSO _4, 4 g di L-asparagina, 2 g di acido citrico, 0,05 g di citrato ferrico di ammonio, 60 ml di glicerolo in 900 ml di acqua. Regolare il pH a 7,0 con NaOH. Autoclave, fresco e appena prima di iniziare l'esperimento, ZnSO ₄ aggiungere sterile ad una concentrazione finale di 0,1% w / v Dal 7000 mc ² è un auxotroph pantotenato questo sforzo richiede anche l'acido pantotenico al 10μg/mL di concentrazione finale.

Discussione

La tubercolosi (TB), causata da l'infezione di Mycobacterium tuberculosis, rimane una grave minaccia per la salute pubblica globale. Quasi un terzo della popolazione mondiale è stimata essere asintomatica infettati dal patogeno, circa 9 milioni di nuovi casi appaiono in clinica ogni anno con sintomi di TB attiva e circa 1,7 milioni muoiono di infezione ogni anno ^11. L'enorme peso della malattia è principalmente contribuito la mancanza di un vaccino e di una chemioterapia altamente complessa c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatrice	VWR international	Modello # 1923/25
Flaconi di coltura in polistirene	Fisher Scientific	03-374-300
Piastra di coltura in tessuto a 12 pozzetti	VWR international	62406-165
Tubi conici da 50 mL	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Refrigeratore cromatografico	VWR international	55702-520
Piastra di Petri	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasico)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagina	Sigma-Aldrich	A4284-100G
acido citrico	Sigma-Aldrich	C1857-100G
citrato ferrico ammonico	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glicerolo	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
acido D-pantotenico	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Arricchimento Middlebrook OADC	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
Flacone da 250 mL per conservazione	Corning	430281
Piastre a 12 pozzetti	Falcon BD	353043
rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-1G
metanolo	JT Baker	9070-05
siringa da 10 mL	BD Biosciences	301604
Punte per pipetta da 1-200μL	VWR international	89079-458
Parafilm M	VWR international	PM-996
Tubo da centrifuga da 15 mL	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasico)	Sigma-Aldrich	S0876-500G