I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco Aplysia

Summary

Si dimostra come cambiamenti nella concentrazione di calcio libero intracellulare ed efficacia sinaptica possono monitorare in un preparato di ganglio Aplysia. Abbiamo immagine calcio intracellulare utilizzando un colorante fluorescente, Orange calcio, e indurre e controllare la trasmissione sinaptica con taglienti (intracellulare) elettrodi.

Abstract

È stato suggerito che le variazioni di calcio intracellulare mediano l'induzione di un certo numero di importanti forme di plasticità sinaptica (ad esempio, facilitazione homosynaptic) ^1. Queste ipotesi possono essere testati contemporaneamente seguire l'evoluzione del calcio intracellulare e alterazioni in termini di efficacia sinaptica. Si dimostra come questo può essere realizzato combinando calcium imaging con tecniche di registrazione intracellulari. I nostri esperimenti sono condotti in un ganglio vestibolare del mollusco Aplysia californica. Questa preparazione ha una serie di caratteristiche vantaggiose sperimentalmente: Ganglia può essere facilmente rimosso dal Aplysia ed esperimenti utilizzare neuroni adulti che rendono normali connessioni sinaptiche e hanno una distribuzione normale canale ionico. A causa del basso tasso metabolico dell'animale e le temperature relativamente basse (14-16 ° C) che sono naturali per Aplysia, preparati sono stabili per lunghi periodi di tempo. ent "> Per rilevare le variazioni di calcio libero intracellulare useremo la versione impermeant cella di calcio Orange ² che è facilmente 'caricato' in un neurone tramite ionoforesi. Quando questo colorante fluorescente lunghezza d'onda lunga si lega al calcio, aumenta l'intensità di fluorescenza. calcio Orange ha veloci proprietà cinetiche ³ e, a differenza di coloranti raziometrici (ad esempio, Fura 2), non necessita di ruota portafiltri per l'imaging. E 'abbastanza stabile e meno foto fototossiche di altri coloranti (ad esempio, fluo-3) ^2,4. Come tutti i non-raziometrico coloranti, calcio Arancione indica variazioni relative di concentrazione di calcio. Ma, poiché non è possibile tener conto delle variazioni concentrazione di colorante dovute al carico e diffusione, non può essere calibrato per fornire concentrazioni di calcio assoluti.

Un montante, fisso stadio, microscopio composto è stato usato per i neuroni di immagine con una fotocamera CCD in grado di registrare circa 30 fotogrammi al secondo. In questo Aplysia risoluzione temporaleè più che sufficiente per rilevare anche un singolo picco alterazione indotta nella concentrazione di calcio intracellulare. Elettrodi Sharp sono contemporaneamente utilizzati per indurre e registrare la trasmissione sinaptica in neuroni identificati pre-e post-sinaptico. Al termine di ogni prova, uno script personalizzato combina elettrofisiologia e dati di imaging. Per garantire la corretta sincronizzazione usiamo un impulso di luce da un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. La manipolazione dei livelli di calcio presinaptici (ad esempio tramite iniezione intracellulare EGTA) ci permette di testare ipotesi specifiche, riguardanti il ​​ruolo del calcio intracellulare nel mediare le varie forme di plasticità.

Protocol

1. Preparazione

1. Anestetizzare l'animale mediante iniezione di 75-100 ml di soluzione isotonica di cloruro di magnesio. L'Aplysia che usiamo per l'imaging sono in genere 150-200 grammi e sono ottenuti da Marinus scientifico.
2. Pin anestetizzato l'animale a un piatto coperto di cera. Aghi per siringhe funzionano bene per questo scopo; tecniche sterili non sono necessari. Utilizzo di pinze e forbici lordi standard, fare un'incisione nel piede dell'animale ed esporre la massa buccale. Individuare il ganglio vestibolare. Utilizzo di forbici e pinze a molla raffinati, cura gratuitamente il ganglio, tagliando tutti i nervi vestibolari.
3. ....

Discussion

Dimostriamo tecniche che possono essere utilizzati per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e di valutare l'efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche sono utili per determinare in che modo le varie forme di plasticità a breve termine sono mediati.

L'immagine viene eseguita con un microscopio a fluorescenza e camera CCD. Questi requisiti apparecchiature sono relativamente modesta se confrontata con la maggior parte di imaging funzionale s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commento
Calcio Arancione	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Calcio kit di calibrazione del buffer	Invitrogen	C-3008MP	utile per testare la sensibilità e la gamma dinamica del segnale
Magnesio cloruro esaidrato	Sigma	M0250	utilizzato in soluzione 0,33 M di anestetizzare animale

Attrezzature Nome	Azienda	Commento
FN-1 microscopio a fluorescenza in posizione verticale	Nikon Instruments	con Narishige ITS-FN1 stadio
NMN-21 manipolatori	Narishige	montato sul palco con i magneti
CoolSNAP HQ 2 CCD	Fotometrici
NIS elementi AR (Versione 3.22)	Nikon Instruments	software di imaging utilizzato per acquisire dati di fluorescenza
10X/0.3w Plan Fluor obiettivo	Nikon Instruments	questa lente immersione ha una distanza molto lunga di 3,5 mm
X-Cite 120 lampada ad alogenuri metallici PC	EXFO	utilizzata per l'imaging di fluorescenza
LS-DWL lampada alogena	Sumica
ET-CY3 filtro set	Tecnologia Chroma	;
Potenza 1401 A / D converter	Cambridge Electronic Design	il campionamento è stato fatto a 3 kHz
Spike II (Versione 7,07)	Cambridge Electronic Design	Il software utilizzato per l'acquisizione dei dati di elettrofisiologia
SEC-10 LX amplificatore	NPI elettronica	utilizzato con un headstage 10X
Modello 410 amplificatore	Brownlee di precisione	utilizzato per amplificare e filtrare il segnale
WS-4	meno k Tecnologia	isolamento dalle vibrazioni per l'imaging
tavolo di raffreddamento	su misura	lastra di ottone attraverso cui l'acqua viene pompata ghiaccio a tasso variabile