Descriviamo una modificato caldo acquosa-fenolo metodo di estrazione per purificare lipopolisaccaride (LPS) da batteri Gram-negativi. Una volta estratto, le LPS può essere successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e visualizzati tramite colorazione diretta o immunoblot occidentale.
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Articolo metodologico
Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lipopolisaccaride (LPS) è un componente principale delle membrane batteriche Gram-negativi esterni. Si tratta di una molecola composta dal lipide A, che è incorporato nella membrana esterna, un oligosaccaride e ripetibile nucleo O-antigene unità che si estendono verso l'esterno dalla superficie della cella 1, 2. LPS è una molecola immunodominante che è importante per la virulenza e patogenesi di molte specie batteriche, tra Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Escherichia coli e 3-5, e le differenze di LPS O-antigene composizione forma la base per la sierotipizzazione di ceppi. LPS è coinvolto in attaccamento alle cellule ospiti all'inizio della infezione e fornisce protezione da complemento-mediata uccisione; ceppi privi LPS può essere attenuato per virulenza 6-8. Per queste ragioni, è importante visualizzare LPS, in particolare da isolati clinici. LPS visualizzando bande modelli e il riconoscimento da uno specificontibodies possono essere strumenti utili per identificare i lignaggi di deformazione e caratterizzare i vari mutanti.
In questa relazione, si descrive un hot-fenolo acquoso metodo per l'isolamento e la purificazione di LPS da cellule batteriche gram-negativi. Questo protocollo consente l'estrazione di LPS lontano da acidi nucleici e proteine che possono interferire con visualizzazione di LPS che si verifica con brevi e metodi di estrazione meno intensi 9. LPS preparato in questo modo possono essere separati da sodio dodecil solfato (SDS)-poliacrilammide gel elettroforesi (PAGE) e direttamente colorati usando carboidrati / glicoproteina macchie o normali metodi di colorazione d'argento. Molti anti-sieri di LPS contenere anticorpi che cross-reagiscono con le proteine della membrana esterna o altri bersagli antigenici che possono ostacolare la reattività osservati dopo immunoblot occidentale SDS-PAGE separate da lisati cellulari grezzi. Proteasi trattamento di lisati cellulari grezzi da sola non è sempre un modo efficace per rimuovere questosfondo di utilizzare questo o altri metodi di visualizzazione. Inoltre, il trattamento della proteasi esteso nel tentativo di eliminare questo sfondo può portare a LPS scarsa qualità che non è ben risolto da uno qualsiasi dei metodi summenzionati. Per queste ragioni, riteniamo che il seguente protocollo, adattato da Westpahl Jann e 10, è l'ideale per l'estrazione LPS.
Protocollo
1. Preparazione di batteri per l'estrazione LPS
- Avviare una cultura pernottamento in 5 ml di Luria Broth (LB), integrato con antibiotici se necessario. Grow coltura durante la notte (12-18 ore) in un incubatore agitazione a 37 ° C e 200 rpm.
- Diluire il 01:10 cultura con LB e prendere un 600 lettura OD in uno spettrofotometro. Sulla base della lettura 600 OD, una sospensione 1,5 mL dei batteri ad una OD 600 di 0,5.
- Pellet i batteri in una microcentrifuga a 10.600 xg per 10 minuti. Rimuovere e scartare il surnatante. Il pellet può essere conservato a -20 ° C, se LPS non sta per essere estratto....
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Discussione
Abbiamo descritto un metodo di purificazione LPS lontano dagli altri componenti cellulari, tra cui gli acidi nucleici e proteine. Questo metodo consente di alta qualità LPS che possono essere utilizzati in un certo numero di metodi di visualizzazione differenti, compresa la colorazione carboidrati di SDS-PAGE gel, come mostrato nella Figura 1. Questo metodo può essere utilizzato per sierotipo LPS da una varietà di ceppi, utilizzando specifici anti-sieri, o per mostrare connessione tra isolati tramite visualizzazione dir.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health e dalla Fondazione Fibrosi Cistica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| DNasi ricombinante, RNasi-free | Roche | 04716728001 | |
| RNasi A | Roche | 10109169001 | |
| Proteinasi K | Pescatore | BP1700 | |
| Tris-saturi Fenolo | Pescatore | BP1750-100 | |
| Etere etilico | Thomas Scientific | C313K31 | |
| Pro-Q Emerald 300 Gel Kit Lipopolisaccaride Stain | Molecular Probes | P20495 |
Riferimenti
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Valvano, M. A. Export of O-specific lipopolysaccharide. Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).
- Pier, G. B.
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Ristampe e permessi
