Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

Sommario

Un metodo per rapidamente volatili ospitanti schermo vegetali mediante la misurazione della risposta elettrofisiologica dei orangeworm ombelico adulti ( Amyelois transitella) Antenne per singoli componenti e miscele tramite l'analisi electroantennographic è dimostrata.

Abstract

Volatili vegetali svolgono un ruolo importante in pianta-insetti interazioni. Gli insetti erbivori utilizzare sostanze volatili vegetali, noti come cairomoni, per individuare la loro pianta ospite. ^1,2 Quando una pianta ospite è un importante agronomica danni alimentazione merce da insetti in grado di infliggere gravi perdite economiche ai produttori. Di conseguenza, cairomoni può essere utilizzato come attrattivi per adescare o confondere questi insetti e, quindi, di offrire un'alternativa ecologica ai pesticidi per il controllo degli insetti. ³ Purtroppo, le piante in grado di emettere un vasto numero di volatili con composizioni diverse e rapporti di emissioni dipendenti dalla fenologia della merce o del momento della giornata. Questo rende l'identificazione di componenti biologicamente attivi o miscele di componenti volatili un processo faticoso. Per aiutare ad identificare i componenti bioattivi delle emissioni degli impianti ospitanti volatili che utilizziamo il laboratorio-based electroantennography biotest screening (EAG). EAG è uno strumento efficace per valutare e regid elettrofisiologicamente le risposte olfattive di un insetto attraverso i loro recettori antennali. Il processo di screening EAG può aiutare a ridurre il numero di volatili sottoposti a test per individuare promettenti componenti bioattivi. Tuttavia, test biologici EAG solo forniscono informazioni sull'attivazione dei recettori. Esso non fornisce informazioni sul tipo di comportamento degli insetti del composto provoca, che potrebbe essere uno attrattivo, repellente o altro tipo di risposta comportamentale. Volatili che provochino una risposta significativa da EAG, rispetto a un controllo adeguato positivo, sono in genere assunto per ulteriori test di risposte comportamentali della peste di insetto. Il disegno sperimentale presentato in dettaglio la metodologia utilizzata per lo screening a base di mandorle volatili piante ospiti ^4,5 attraverso la misurazione delle risposte elettrofisiologiche antennali di un adulto dell'ombelico orangeworm insetto parassita (Amyelois transitella) ai componenti singoli e semplici miscele di componenti tramite EAG biotest. Il metodo utilizza due exantenne cised nel mezzo di una porta "fork" elettrodo. Il protocollo ha dimostrato qui presenta un rapido, high-throughput metodo standardizzato per volatili di screening. Ogni volatile è in un determinato, costante per standardizzare il livello stimolo e quindi consentire risposte antennali indicativa del chemoreceptivity relativa. Il controllo negativo aiuta ad eliminare la risposta elettrofisiologico sia forza di solvente residuo e meccanica della sfoglia. Il controllo positivo (in questo acetofenone esempio) è un composto singolo che ha suscitato una risposta coerente da maschio e femmina ombelico orangeworm (NOW) falena. Uno standard semiochemical supplementari che fornisce risposta coerente e viene utilizzato per studi di saggio biologico con il maschio NOW tignola è (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, un componente aldeide dalla femmina prodotta feromone sessuale. ^6-8

Protocollo

1. Preparazione di sostanze volatili Riconosciuto dalla pianta ospite per EAG Screening

1. Dopo l'identificazione e l'autenticazione appropriato di tutti i volatili mediante GC-MS, eseguire l'analisi EAG soffio di ogni volatili disponibili. Lo screening iniziale può essere un numero basso di replica risposte antennali (N = 3-5) per ciascun sesso, al fine di ottenere una indicazione di chemoreceptivity relativa in un breve lasso di tempo (Tabella 1).
2. Preparare una soluzione di ogni volatili ad una mg / mL concentrazione 5 in pentano. Sigillare ermeticamente e conservare in frigorifero fino al momento del campione per l'uso immediato (ad esempio, acetofenone, densità = 1,03 g / mL, volume = (0,005 g/1.03 g / mL) x 1,000 = 4,85 microlitri di acetofenone in un pallone 1,0 ml e diluire a 1,0 mL con pentano).
3. Poco prima dell'analisi EAG, rimuovere fiale contenenti il ​​5 mg / ml concentrazione di sostanze volatili da testare e permettono di riscaldare a temperatura ambiente. Nel frattempo, l'etichetta del numero corretto di pipette Pasteurcorrispondono a ciascuna volatili da testare, e avvolgere un piccolo pezzo di parafilm (ca. 15 x 15 mm) sopra la punta della pipetta. Per i primi 10 pipette di screening di stimolo (N = 4 per ogni maschio e femmina) vengono caricati in caso di cattiva preparazione o altro ostacolo imprevisto.
4. Utilizzando un paio di pinzette, piegare leggermente il disco saggio biologico in mezzo per facilitare il posizionamento nella pipetta, poi parzialmente inserire il disco piegato nel grande fine della pipetta in modo che ca. 2-3 millimetri del disco sono esposti. Allineare le pipette etichettati e preparata in un contenitore rack.
5. Utilizzando una pipetta o siringa, caricare 10 L (50 pg) di soluzione volatile su ciascun disco e consentire 2 minuti prima di passare completamente inserire dischi nella pipetta. Una volta caricato, immediatamente sigillare l'estremità della pipetta con parafilm (ca. 15 x 30 mm). La quantità di stimolo volatile per essere caricati e gonfio è molto probabile che variano a seconda delle specie di insetti.
6. Seguendo lo stesso protocollo notato sopra per preparare i controllicomprendono in ogni analisi. Per il carico negativo di controllo 10 microlitri di appena pentano su ogni disco, attendere 2 minuti, caricare nella pipetta etichetta e sigillo. Per il controllo positivo, caricare 10 L (50 mg) sul disco, attendere 2 minuti, il carico nella pipetta etichetta, e sigillare con parafilm.
7. La vitalità della preparazione insetto antennale molto probabile che variano a seconda delle specie, ma abbiamo scoperto che Amyelois transitella antenne tipicamente rimanere attivi e coerente per> 30 minuti dopo l'escissione utilizzando il protocollo descritto. Questa quantità di tempo generalmente consentire fino a 4-10 volatili campioni da valutare. Tabella 2 fornisce un esempio di tempi e sequenze.

2. Preparazione delle antenne degli insetti per l'EAG Bioassay

1. L'obiettivo di questo esperimento è EAG analisi, quindi, l'ipotesi che ogni investigatore avrà accesso a insetti allevati in modo appropriato.
2. Per questo esperimento studieremo 3-4 giorni olod, accoppiati falene maschio e femmina. Falene individuali vengono trasferiti in un piccolo, con coperchio, contenitore di plastica il giorno di analisi. Immediatamente prima della prova biologica, la falena da testare viene trasferito a capofitto in un apparato di supporto (ad esempio, a base di vari consigli pipettatori di plastica) e sicuro da dietro. La manipolazione del insetto può essere visto sotto un basso consumo stereo-microscopio per facilitare escissione.
3. Antenne sono preso in giro con filo di punta strumento. Il titolare forcella, con un piccolo film di gel dell'elettrodo, viene posto in prossimità per il trasferimento rapido di antenne. La prima antenna viene asportato mediante forbici micro e sulla forcella, assicurando la base dell'antenna è posto sul non-rosso porzione della forcella (l'elettrodo di massa indifferente). Un set timer per 10 minuti viene avviato e la seconda antenna viene asportato e posizionato vicino alla prima antenna con le due basi sullo stesso lato della forcella.
4. In alternativa, le antenne possono essere lasciati sicurezza all'interno del holdinTubo g, asportato, quindi delicatamente rimosso dal tra il tubo e l'insetto con un filo a punta utensile con una piccola quantità di gel sul fondo.
5. Antenne vengono controllati per garantire la base e la punta sono immersi in gel dell'elettrodo e bolle sono presenti nel gel. Le estremità / suggerimenti può essere tagliata per garantire la piena esposizione al gel per elettrodi. Si dovrebbe essere utilizzato per garantire che la parte restante di ciascuna antenna non è coperto con gel, garantendo così la massima area superficiale antennale è esposta al soffio.
6. La forcella adeguatamente trattata viene poi inserita nella sonda pre-amplificatore e mantenuto sotto un flusso costante di aria umidificata a 200 mL / min per il tempo rimanente del periodo di attesa di 10 minuti. Il tempo di accise e EAG tempi di inizio sono noti (Tabella 2) e 30 secondi prima del soffio primo stimolo, la pipetta contenente il controllo positivo viene sigillata e posta in cui il supporto viene regolata per dirigere aria / sfoglia flusso 2-3 mm dal il prepped antenne.
7. Dopo ogni esperiiment, le falene di prova sono sacrificati in un ambiente di ghiaccio secco e ben disposti.
8. Falene femminili sono sezionati per verificare lo stato di accoppiamento. Maschi conviventi si presume che siano accoppiati.

3. EAG protocollo per i singoli componenti

1. Risposte antennali sono registrati tramite il software incluso AutoSpike con lo strumento EAG Syntech. La configurazione nella scheda Proprietà AutoSpike per il canale con la sonda EAG è impostato su una frequenza di campionamento di 106,7, NO alla rettifica, e un filtro di 0-42 Hz. Per la scheda Filter, il filtro EAG è acceso e il basso-cutoff è impostata a 0,1 Hz.
2. Sbuffi di stimolo sono 1-2 secondi di durata. Un timer impostato per 1 minuto viene avviato dopo ogni puff.
3. La pipetta prossimo test volatile è sigillata e posta nel supporto. La sequenza di volatili prove, randomizzati fra corre per garantire che non composti di prova costante seguire un altro test volatile, viene quindi seguita (ad esempio, Tabella 2) accuratamente allowing 1 minuto tra sbuffi.
4. Per facilitare la facilità di leggere le risposte EAG, porzioni di governanti sono posti sullo schermo del computer e il livello di base all'apice del segnale di deflessione verso il basso viene misurata in mm e registrato su un foglio di dati (ad esempio, per l'impostazione 5 mV, 33 mm = 2,5 mV). Il software ha la capacità di riproduzione delle registrazioni salvate per analisi future. Conversione di millimetro a uno mV o mV di ampiezza viene eseguita in un secondo momento l'analisi dei dati.
5. Dopo la sfoglia finale controllo positivo (ad esempio, record # 12) viene somministrato, le antenne sono rimossi, la forcella viene pulita con un etanolo saturo pulire e lasciati asciugare prima dell'uso successivo.
6. Per aumentare il throughput dei saggi, l'asportazione della prossima serie di antenne può essere avviato da un personale di laboratorio secondo circa 10 minuti prima della fine della sperimentazione in corso - dopo il quarto soffio, la seconda prova volatile l'esperimento in corso, come da tabella 2. Ciò consentirà for l'inizio del successivo esperimento direttamente dopo la fine dell'esperimento attuali.
7. Maggiore il numero di repliche (su antenne differente) possono essere eseguite su composti di interesse per fornire ulteriore validazione statistica.

4. Un esempio di analisi EAG di miscele o di altre matrici (Tabella 3)

1. Successivamente, i rapporti e dei volumi delle due miscele terziarie (3 componenti miscele) sono calcolati per fornire un esempio di combinazione di sostanze volatili scatenanti risposte EAG elevati (Tabella 4). I calcoli sono per alcuni rapporti di base, un rapporto 1:1:1 molare di α-humulene: 2-undecanone: 2-feniletanolo e quindi confrontando ad un rapporto seconda miscela di 1:2:4.
2. Utilizzando protocolli simili descritto in precedenza, le miscele vengono preparate e etichettati pipette Pasteur vengono caricati insieme con i necessari controlli positivi e negativi.
3. I campioni di volatili sono gonfiati attraverso antenne maschile e femminile e le risposte vengono misurate e loggatoun foglio di dati (Tabella 3).

5. Risultati rappresentativi

Per orangeworm ombelico femminile le impostazioni vengono utilizzati i seguenti: 2 sbuffi secondo, 10 volte seconda registrazione, 10 seconda finestra, e 5 di scala mV. Una flessione negativa è la risposta tipica, ma il valore assoluto viene registrato (ad esempio, -3400 mV deflessione viene registrato come 3400 mV). Una risposta relativamente debole della preparazione per il controllo positivo viene scartato. Figura 1 fornisce una rappresentazione grafica di una scarsa risposta al controllo positivo orangeworm ombelico.

Ad esempio di un risultato scarso controllo, la risposta media femmina antenne a acetofenone è tipicamente ca. 2600 mV (figura 2), se la preparazione solo ha dato una risposta di ca. 1300 mV si sarebbe essere scartato e un'altra coppia di antenne prepped. Allo stesso modo, la risposta media maschile (Z, Z) -11,13-hexadecadienal era Typically 3000 mV, quindi, qualsiasi risposta meno di 1.500 mV è stato scartato in genere.

Il controllo positivo all'inizio e alla fine di ciascun esperimento fornisce inoltre informazioni relative alla condizione delle antenne. Una regola pratica seguiamo per lo screening rapido è se la risposta antennale al soffio del post-controllo (record # 12, tabella 2) o è inferiore al 75% del 1 ^° soffio del pre-controllo (record # 1 , Tabella 2) o inferiore al 2 ^° soffio del pre-controllo (record # 2, Tabella 2) allora l'esperimento non viene utilizzato nell'analisi dei dati a causa di possibile degradazione del prep (Figura 3). Un esempio della prima regola del pollice sarebbe record # 1 = 2730 mV e record # 12 = 1680 mV, e la seconda regola del pollice se il record # 2 = 2350 mV e record # 12 = 1680 mV, In ciascuno di questi casi , i risultati dell'esperimento preparazione e sarebbero scartati.

Aesempio rappresentativo di correggere i valori di risposta EAG misurati al controllo positivo sarebbe il seguente.

Esegui #	EAG (mV)	Esegui # 2	EAG (mV)	Run # 3	EAG (mV)
(+) Ctrl	2800	(+) Ctrl	2420	(+) Ctrl	3030
A Cmpnd	3000	A Cmpnd	2500	A Cmpnd	3440
(-) Ctrl	530	(-) Ctrl	755	(-) Ctrl	910
Cmpnd B	2400	Cmpnd B	2000	Cmpnd B	2560
(+) Ctrl	2770	(+) Ctrl	2400	(+) Ctrl	3020

Utilizzando i valori sopra indicati per uno = N 3 esperimento, la risposta controllo negativo è sottratto da tutti i valori all'interno di ciascun esperimento assumendo il controllo negativo è la risposta di base antennale al soffio meccanica e di solvente residuo.

Run # 1	EAG (mV)	Esegui # 2	EAG (mV)	Run # 3	EAG (mV)
(+) Ctrl	2270	(+) Ctrl	1665	(+) Ctrl	2120
A Cmpnd	2470	A Cmpnd	1745	A Cmpnd	2530
(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0	(-) Ctrl	0
Cmpnd B	1870	Cmpnd B	1245	Cmpnd B	1650
(+) Ctrl	2240	(+) Ctrl	1645	(+) Ctrl	2110

I controlli positivi per ogni esperimento sarebbe quindi essere mediati e corretti a 1.000 mV, notando il rapporto per la correzione a 1.000 mV. Un foglio di dati (ad esempio, Excel) possono essere facilmente strumentalizzate per convertire le risposte ai dati utilizzabili.

Run # 1	Avg (mV)	Esegui # 2	Avg (mV)	Run # 3	Avg (mV)
(+) Ctrl	2255	(+) Ctrl	1655	(+) Ctrl	2115
(+) Ctrl adj.	1000 (0.443)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.604)	(+) Ctrl adj.	1000 (0.473)

Moltiplicando per il rapporto di correzione all'interno di ciascun esperimento, i valori di composto A e B composto vengono poi regolati.

Run # 1	Adj. EAG (mV)	Esegui # 2	Adj. EAG (mV)	Run # 3	Adj. EAG (mV)
A Cmpnd	1094	A Cmpnd	1054	A Cmpnd	1197
Cmpnd B	828	Cmpnd B	752	Cmpnd B	780

Le medie (mezzi) per ciascun composto sono quindi determinate insieme ad altri dati statistici pertinenti e le risposte EAG per i composti testati possono essere valutatiper la candidatura per ulteriori indagini.

Composto	EAG (mV)	No. Funziona, N =
A	1115	3
B	787	3

Figura 1. EAG Rappresentante per i maschi la risposta antennale (1.180 mV) al pre-controllo (1 sfoglia ^st controllo positivo) che verrebbero scartati a causa di una scarsa risposta antennale dopo aver assicurato le antenne hanno un buon contatto con il gel. Barre blu in Windows fondo rappresentano il soffio due secondi di volatile. Clicca qui per ingrandire la figura .

Trong> Figura 2. EAG Rappresentante per la risposta femminile antennale (3.400 mV) al 1 ^° sfoglia pre-controllo che dovrebbero essere considerati tali. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. EAG Rappresentante per la risposta femminile antennale (1.680 mV) per il controllo a posteriori (ultimo controllo positivo per ciascun esperimento) che potrebbero essere considerati poveri, e suggestivo delle antenne degradazione (<75% del 1 ^° pre-controllo o < 2 ^° puff valore di pre-controllo). Per questo esempio, il 1 ^° pre-controllo è stato puff 2730 mV e 2 ^° pre-controllo è stato puff 2350 mV. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 4. Rappresentante EAG per la risposta femminile antennale (3.800 mV) al soffio di una miscela candidato volatile e le misure successive la deformazione massima iniziale (3800 mV), la pendenza iniziale per tutta la durata soffio (0,3 mV = s/1.2 0.25 s / mV), e la pendenza per la durata rimanente sfoglia (1,6 mV s/1.9 = 0.84 s / mV). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Piccola imbarcazione modificato contenente una matrice di campione e volatili associati per essere soffiato in A. transitella antenne.

Tabella 1. In sITU emissioni volatili di mandorle impareggiabile (2007) e le risposte EAG determinati da una configurazione diversa e meno sensibile nel programma Autospike.

Tabella 2. Esempio di un modulo per la registrazione delle risposte antennali maschili e femminili ai singoli componenti volatili.

Tabella 3. Esempio di un modulo per la registrazione delle risposte antennali maschili e femminili alle miscele volatili e / o bouquet.

Tabella 4. Esempi di preparazione di 10 mL di 5 mg / mL di soluzione per due diversi rapporti di miscele.

Tabella 5. Esempio di modulo per la registrazione due conseguenzesbuffi consecutivi di singoli componenti volatili attraverso antenne maschile e femminile.

Discussione

Uso delle registrazioni electroantennogram come un saggio biologico per determinare le risposte chemorecezione di un insetto bersaglio è abbastanza comune e numerosi studi che utilizzano EAG come rivelatore per effluenti da un cromatogramma gas (GC-EAD) possono essere trovati nella letteratura. ^9,10 Il metodo illustrato fornirà uno screening rapido di quantità equivalenti di componenti volatili con le repliche di alta fiducia per l'assegnazione della relativa risposta. Il programma AutoSpike nel software ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Acetofenone	Alfa Aesar-	A12727	Female controllo positivo
(Z, Z) -11,13-Hexadecadienal	Suterra		Maschio controllo positivo
α-Humulene	Aldrich	53675	Sesquiterpene
2-Undecanone	Aldrich	U1303	Derivato di acido grasso
2-feniletanolo	Aldrich	77861	Benzonoidi
Pentano	EMD	PX0167-1	Solvente
4 canali di acquisizione di controllo	Syntech	IoDAC-4
EAG sonda, pre-amplificatore	Syntech	PRG di tipo-2
Antenna titolare	Syntech	Per PRG-2	Fork elettrodo
Stimolo di controllo	Syntech	CS-55	Del flusso d'aria e sbuffi
Spectra elettrodi Gel	Parker	12-02
Saggi biologici dischi	Whatman	2017-006	6 millimetri
Pipette Pasteur	VWR	14673-010	5 ¾ "(14,6 cm)
Parafilm M	Bemis	PM-992