Un metodo enumerazione CD4, la α-test, viene descritto che utilizza saliva intera per fornire rapidi e precisi conta di CD4. Le α-test centesimi i costi ed elimina la necessità di una formazione tecnica, reagenti costosi come gli anticorpi monoclonali, strumentazione, refrigerazione, trasporto dei campioni, nonché di raccolta e trattamento del sangue.
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Articolo metodologico
La α-test: Rapid cell-free CD4 Enumeration Uso Saliva Whole
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vi è un urgente bisogno di conteggio CD4 a prezzi accessibili per monitorare la malattia da HIV. Conteggio CD4 è fuori portata nelle regioni a causa del tempo e le limitazioni di temperatura, sofisticazione tecnica, e il costo dei reagenti risorse limitate, in particolare per misurare gli anticorpi monoclonali CD4 sulle cellule del sangue, l'unico metodo attualmente accettabile. Un laboratorio comunemente utilizzati risparmio di costi e risparmio di tempo strategia è quella di calcolare, piuttosto che i valori ematici certa misura. Per esempio, livelli di LDL sono calcolati utilizzando i livelli misurati di colesterolo totale, HDL, e trigliceridi 1. Pertanto, l'identificazione di cellule libere correlati che regolano direttamente il numero di cellule T CD4 + potrebbe fornire un metodo preciso per calcolare CD4 per l'importanza fisiologica dei correlati.
Il numero di cellule staminali che entrano sangue e sono destinate a diventare circolanti cellule CD4 + T è determinata dalla chemiochina uno CXCL12nd suo recettore CXCR4 per la loro influenza sulla locomozione 2. Il processo di locomozione di cellule staminali nel sangue viene ulteriormente regolata dalla cellula umana superficie dei leucociti elastasi (HLE CS) e la CS-reattivo HLE attivo α 1 inibitore della proteinasi (α 1 PI, α 1 antitripsina, SerpinA1) 3. In malattia da HIV-1, α 1 PI è inattivato a causa di processi patologici 4. Nei primi categorie asintomatici di HIV-1 malattia, attiva α 1 PI è risultata inferiore normale in 100% di non trattati pazienti HIV-1 (mediana = 12 pM, e per ottenere livelli normali durante le categorie sintomatici 4, 5. Questo modello è stata attribuita a inattivazione immune, non alla sintesi insufficiente, inattivazione proteolitica, o ossigenazione. Abbiamo osservato che in HIV-1 soggetti con> 220 cellule CD4 / microlitro, CD4 sono stati correlati con i livelli sierici di accesso α 1 PI (r 2 = 0.93, p < 0.0001, n = 26) e gli inattivi α 1 PI (r 2 = 0.91, p <0.0001, n = 26) 5. La somministrazione di α 1 PI per HIV-1 i soggetti infetti e non infetti portato a un drastico incremento nella conta dei CD4 suggeriscono α 1 PI partecipa alla regolazione del numero di cellule T CD4 + nel sangue 3.
Con la stimolazione, la saliva contiene tutto sufficiente essudato sieroso (plasma contenente materiale proteico che passa attraverso le pareti dei vasi sanguigni nella saliva) per consentire la misurazione delle attività α 1 PI e la correlazione di questa misura è la prova che si tratta di un metodo preciso per calcolare il numero di CD4. Brevemente, sialogogues come gomma da masticare o acido citrico stimolare l'essudazione di siero in saliva intera bocca. Dopo stimolando essudazione siero, l'attività di siero α 1 PI in saliva è misurata dalla sua capacità di inibire l'attività elastasi. Suina elastasi pancreatica (PPE)è facilmente disponibile una fonte economica di elastasi. PPE lega α 1 PI formando uno-a-uno complesso che impedisce PPE di scindere i suoi substrati specifici, uno dei quali è il peptide colorimetriche, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Incubazione saliva con una concentrazione di saturazione di PPE per 10 min a temperatura ambiente consente il legame di PPE a tutti attivo α 1 PI nella saliva. L'inibizione di PPE risultante dalla attivo α 1 PI può essere misurata aggiungendo il substrato PPE SA 3 NA. (Figura 1). Sebbene CD4 sono misurate in termini di volume di sangue (cellule CD4 / pl), la concentrazione di α 1 PI nella saliva è correlata alla concentrazione di siero in saliva, non al volume di saliva dal volume può variare notevolmente durante il giorno e persona a persona 6. Tuttavia, quasi tutte le proteine nella saliva è dovuto al contenuto di siero, e il contenuto di proteine della saliva è measurable 7. Così, attivo α 1 PI in saliva viene calcolato come rapporto al contenuto proteico e saliva viene chiamata α 1 Index PI. I risultati qui presentati dimostrano che la α 1 Index PI fornisce un metodo accurato e preciso fisiologico per il calcolo CD4.
Protocollo
1. Preparare freschi soluzioni di lavoro
- TBS: 0,05 M Tris Buffered Saline, pH 7.8 (TBS). Preparare 60 ml TBS / micropiastra.
- PPE: elastasi pancreatica suina, di tipo 1 (PPE) viene fornito come sospensione. Agitare bene e diluire DPI in TBS a circa 0,01 U / ml. Preparare 6 ml soluzione di lavoro / micropiastra).
- SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Preparare 0,1 M magazzino SA 3 soluzione NA in dimetilsolfossido (DMSO) e utilizzare immediatamente o conservare a -20 ° C. Preparare 6 ml di soluzione di lavoro / micropiastra diluendo....
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Discussione
Non diluito siero contiene mediana 36 uM α 1 PI e 3,6 uM α 2 macroglobulina (α 2 M) una differenza di 10 volte 8. Entrambe le proteine competono per il legame ai DPI. Queste due caratteristiche, concentrazione e PPE affinità, sono stati sfruttati per sviluppare un metodo che sia in grado di misurare specificamente α 1 PI nel siero normale in presenza di competere α 2 M 8. Questo metodo in grado di rilevare un minimo di 50 μ nM 1 PI.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
La ricerca è stata sostenuta dal Harry Winston Research Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | |
| Sialogogue, 0,05 M di acido citrico | Eda di Caramelle Sugarfree, 4900 posteriore N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 | Sugar-gratuiti gocce di limone | |
| Suini elastasi pancreatica, di tipo 1 (EC 3.4.21.36) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 | E1250 | |
| Succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | S4760 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Di coltura di tessuti trattati con micropiastre, 96 e | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 | 35-3072 | |
| Lettore per micropiastre con filtri per 405 nm e 595 nm | MTX Systems Lab, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 | Dynex P97277 |
Riferimenti
- Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
- Lapidot, T., Petit, I.
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Ristampe e permessi
