Di base Caenorhabditis elegans Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Summary

La facilità di mantenere e diffondere il nematode C. elegans Ne fanno un organismo modello bello lavorare con. La possibilità di vermi sincronizzazione consente di lavorare con una quantità significativa di soggetti alla stessa fase di sviluppo, che facilita lo studio di un processo particolare in molti animali.

Abstract

La ricerca sulla biologia molecolare e dello sviluppo del nematode Caenorhabditis elegans è iniziata nei primi anni settanta da Sydney Brenner e da allora è stato ampiamente utilizzato come organismo modello ^1. C. elegans possiede attributi chiave come la semplicità, la trasparenza e il breve ciclo di vita che ne hanno fatto un adeguato sistema sperimentale per studi biologici di base per molti anni ^2. Scoperte di questo nematode avere vaste implicazioni, perché molti processi cellulari e molecolari che controllano lo sviluppo degli animali sono soggetti ad evoluzione conservate ^3.

C. elegans ciclo di vita passa attraverso uno stadio embrionale e quattro stadi larvali prima che l'animale raggiunge l'età adulta. Lo sviluppo può prendere da 2 a 4 giorni a seconda della temperatura. In ciascuno dei diversi stadi tratti caratteristici possono essere osservati. La conoscenza della sua linea cellulare completo di ^4,5 insieme al annotat profondaione del suo genoma trasformare questo nematode in un grande modello in campi diversi come la neurobiologia ^6, l'invecchiamento ^7,8, biologia delle cellule staminali ⁹ e biologia linea germinale ^10.

Una caratteristica aggiuntiva che rende C. elegans un modello attraente per lavorare con la possibilità di ottenere popolazioni di vermi sincronizzati in una fase specifica attraverso un protocollo di relativamente facile. La facilità di manutenzione e di moltiplicazione questo nematode aggiunta alla possibilità di sincronizzazione fornire un potente strumento per ottenere grandi quantità di vermi, che possono essere utilizzati per una varietà di piccoli esperimenti o ad alta resa come schermi RNAi, microarrays, sequenziamento di massa, immunoblot o ibridazione in situ, tra gli altri.

A causa della sua trasparenza, C. elegans strutture possono essere distinti sotto il microscopio usando microscopia interferenza differenziale contrasto, noto anche come micro Nomarskicopiare. L'impiego di un legante DNA fluorescente, DAPI (4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo), per esempio, può portare alla identificazione specifica e la localizzazione delle singole celle, così come le strutture subcellulari / difetti ad essi associati.

Protocol

1. Protocollo A: Worms coltura per Bleaching ¹¹

Popolazioni di C. elegans può essere ottenuto coltivando loro o in terreni liquidi o su supporti solidi in piastre. Di solito sono cresciuti su un solido NGM (Media crescita nematodi) e alimentate con E. coli, che si aggiungono alle piastre sia vivo o morto (ucciso da UV ^12, dal calore o dal freddo ^{13 14).} La procedura più comune utilizza dal vivo OP50 E. coli, che è carente nella sintesi di uracile e non possono proliferare in uno strato spesso che oscurerebbe i vermi.

1. Mescolare 3 g di NaCl, 17 g di agar e 2,5 g di pepto....

Discussion

Nematode sincronizzazione

Varie soluzioni sono state descritte sbianca. Abbiamo provato cinque diverse ricette (Tabella I) e, nelle nostre mani, non hanno mostrato differenze significative nella sincronizzazione delle popolazioni a vite senza fine (Fig. 1). Tuttavia, i nostri esperimenti ha dimostrato che parametri quali la temperatura (Fig. 2), la soluzione rapporto di sbianca: volume di vermi (Fig. 3) e il volume di M9 con cu.......