Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Sommario

Descriviamo qui una tecnica che viene ora utilizzato di routine per isolare complessi ribosoma stabilmente legati a catena nascente (RNC). Questa tecnica sfrutta la scoperta che un 17 aminoacidi lungo "sequenza di arresto" SECM può fermare l'allungamento traduzione in un procariota ( E. coli) Del sistema, quando inserito (o fusa al C-terminale) di qualsiasi proteina.

Abstract

Numerose ricerche hanno fornito ampie evidenze che suggeriscono che le proteine ​​ripiegare nella cellula è un processo di co-traslazionale ^1-5. Tuttavia, il percorso esatto che segue catena polipeptidica durante la co-traslazionale pieghevole per raggiungere la sua forma funzionale è ancora un enigma. Per comprendere questo processo e di determinare l'esatta conformazione degli intermedi pieghevoli co-traslazionale, è necessario sviluppare tecniche che consentono l'isolamento di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate per consentire loro ulteriori analisi strutturale.

SECM (monitor secrezione) è un aminoacido 170 E. coli proteina che regola l'espressione della valle Seca (guida secrezione) ATPasi nel SECM-seca operone ^6. Nakatogawa e Ito originariamente scoperto che una sequenza amminoacidica 17 lungo (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) nella regione C-terminale della proteina SECM è sufficiente e necessariocausare lo stallo di allungamento SECM a Gly165, producendo così peptidil-glicil-tRNA stabilmente legata alla ribosomiale P-site ^7-9. Ancora più importante, è stato trovato che questa sequenza amminoacidica 17 lungo può essere fusa al C-terminale di qualsiasi proteina a lunghezza intera e / o troncato permettendo la produzione di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate ^7. Così, quando fuse o inserito nella proteina bersaglio, la sequenza SECM stallo produce arresto del l'allungamento della catena polipeptidica e genera RNC stabili in vivo sia in E. coli e in vitro in un sistema acellulare. Centrifugazione in gradiente di saccarosio è inoltre utilizzata per isolare RNC.

I RNC isolati possono essere utilizzati per analizzare le caratteristiche strutturali e funzionali degli intermedi pieghevoli co-traslazionale. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata con successo per acquisire conoscenze nella struttura di alcune catene di ribosoma legati nascenti ^10,11. Qui si descrive l'isolamento di bovino Gamma-B sonoro superiore cristallino RNC fusa SECM e generato in un sistema di traduzione in vitro.

Protocollo

1. Preparazione del DNA template e trascrizione in vitro

1. Il gene di interesse viene clonato in qualsiasi T7 e / o ad esempio promotore SP6 base plasmide. Per ottenere RNC di interesse, C-terminale del polipeptide bersaglio viene esteso aggiungendo inducendo sequenza di arresto SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP ^7. Al fine di garantire che il frammento del polipeptide di interesse sarà estrudere fuori del tunnel ribosomiale, il C-terminale della proteina bersaglio deve essere ampliato di almeno 30 amminoacidi ^12-14. Una glicina-serina linker flessibile ricco può essere introdotto tra la proteina e la sequenza arresto SECM evitare vincoli possibili conformazionali.
2. Per la trascrizione in vitro, DNA stampo deve essere linearizzato con l'enzima di restrizione taglio a valle della ORF. Si deve verificare linearizzazione completa del DNA plasmide eseguendo il prodotto della digestione di restrizione elettroforesi su gel di agarosio.
3. Il plasma linearizzatoid è ulteriormente utilizzato per la reazione di trascrizione in vitro. Diversa concentrazione di DNA stampo può essere testato per identificare concentrazione ottimale di DNA necessarie per la trascrizione in vitro. Generalmente con Kit MEGAscript Ambion Trascrizione di alto rendimento (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 mg DNA linearizzato produce mRNA 40-60 mg. Trascrizione in vitro viene effettuata seguendo le istruzioni del fabbricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) .
4. Dopo la trascrizione in vitro, mRNA viene purificato mediante precipitazione litio cloruro secondo le istruzioni del produttore (Ambion di MEGAscript alta Kit Trascrizione resa, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
5. integrità mRNA è ulteriormente verificato mediante elettroforesi utilizzando acrilammide o gel di agarosio.

2. Traduzione in vitro

Per la traduzione in vitro utilizzando l'RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD), attenersi alla seguente procedura:

1. Preparare 100 pl di istruzione in produttore traduzione in vitro la reazione successivo. In breve, in acqua priva di nucleasi aggiungere 24 microlitri miscela di aminoacidi meno metionina (1 mM), 10 unità di inibitore della ribonucleasi (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi di sostanze radioattive ^[35 S] Biomedicals-metionina (MP, Solon, OH), 20 pl miscela di reazione, 24 microlitri tampone di ricostituzione e 24 pl di E. coli lisato.
2. Incubare la reazione a 30 ° C per 5 min a caldo pre la reazione di traduzione. Aggiungere 1-2 pg di mRNA alla reazione di traduzione e incubare a 30 ° C per 10-15 min.
3. Arrestare la reazione ponendo la reazione di traduzione in ghiaccio.

3. Isolamento del polipeptide nascente dalla reazione di traduzione in vitro

1. Per isolare RNC, la reazione di traduzione è sovrapposto di 4,5 ml di saccarosio gradiente 5-30% in 20 mM HEPES pH 7-KOH0,5, 15 mM MgCl _2, 100 mM acetato di potassio, 1 mM DTT e centrifugati utilizzando Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore.
2. Dopo centrifugazione, gradiente di saccarosio è frazionato per isolare diverse popolazioni ribosomali e le relative catene nascenti. La separazione viene monitorata utilizzando il sistema programmabile ISCO gradiente di densità con registrazione continua a 254 nm, utilizzando un rivelatore ISCO UA-6 assorbanza.
3. La frazione (s) contenente ribosomi 70S vengono raccolti e analizzati ulteriormente a seconda dello scopo dell'esperimento.

4. Osservazione delle proteine ​​al ribosoma con Tris-tricina SDS PAGE

Per verificare, se la proteina SECM estesa rimane attaccato agli anni '70 ribosoma, frazioni del gradiente sono stati raccolti e trattati come segue:

1. Proteine ​​in ciascuna frazione è stata precipitato per aggiunta di acido tricloroacetico (TCA) ad una concentrazione finale del 10% e incubate a 4 ° C overniGHT.
2. Dopo incubazione per una notte, i campioni sono stati centrifugati a 14.000 g per 15 minuti per precipitare la proteina. Dopo la centrifugazione supernatante è stato rimosso e il pellet lavata due volte con acetone soluzione contenente: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet è stato ulteriormente essiccati all'aria e disciolto in SDS-PAGE tampone di caricamento.
3. Il campione trattato è stato risolto e analizzato mediante Tris-tricina SDS-PAGE.
4. Dopo l'elettroforesi, gel sono stati fissati, essiccati sotto vuoto usando gel Dyer e sottoposto ad autoradiografia. La distribuzione dei polipeptidi nascenti stati osservati usando phosphoimaging.

5. Risultati rappresentativi

Qui vi presentiamo un esperimento che descrive l'isolamento del full-length bovina Gamma-B sonoro superiore cristallino stabilmente legata alle 70S dei ribosomi. La figura 1 illustra passaggi necessari per l'isolamento di bovini Gamma-B cristallina RNC. Il C-terminale della Gamma-B sonoro superiore cristallino è stata estesa complessiva da 32 t aminoacidiO Assicurarsi che full-length estrude proteina fuori del tunnel ribosomale, questo include anche la sequenza SECM stallo posto al molto C-terminale del polipeptide di fusione. Seguendo traduzione in vitro, i ribosomi 70S sono stati isolati mediante centrifugazione gradiente di saccarosio (Figura 2.1). Al fine di garantire che la proteina rimane stabilmente legato al ribosoma, i 70S contenenti frazioni sono state riunite, dissalato, tampone scambiate e sottoposto ad una serie supplementare di centrifugazione gradiente di saccarosio (Figura 2.2). Il risultato illustrato nella figura 2 indica chiaramente che SECM può efficacemente indurre arresto traslazionale dei Gamma-B RNC cristallina.

Figura 1. Spiegazione schematica i passi necessari per l'isolamento di RNC. C-terminale di bovini Gamma-B sonoro superiore cristallino è stata prorogata dal 32 sequenza aminoacidica. Questa estesaC-terminale regioni comprende anche la sequenza SECM arresto. Gamma-B sonoro superiore cristallino con la sequenza SECM è stato clonato nel Pivex 2.3 (T7 based) plasmide. Per la trascrizione in vitro del DNA stampo è stato linearizzato con XbaI. Modello linearizzato è stato ulteriormente utilizzato per la trascrizione in vitro. Il T7 nel modello DNA è riconosciuto da RNA polimerasi T7 che trascrive le Gamma-B gene sonoro superiore cristallino a valle del promotore T7. mRNA è stato purificato usando cloruro di litio metodo di precipitazione. Il mRNA purificato è stato poi usato per traduzione in vitro. Dopo l'incubazione, la reazione di traduzione è stato stratificato sopra del gradiente 5-30% di saccarosio e centrifugato in Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore.

Figura 2. Isolamento dei bovini Gamma-B sonoro superiore cristallino RNC stabilmente legato al ribosoma 70S. 1 mRNA pg è stato miscelato in 100 microlitri di reazione E. coli sistema S30 estratto come descritto nella sezione protocollo con 20 uCi ^[35 S]-metionina e incubate a 30 ° C per 15 min. Dopo l'incubazione, la reazione di traduzione è stato stratificato sopra del gradiente di saccarosio 5-30% in 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl _2, 100 mM di acetato di potassio, 1 mM DTT e centrifugato in Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore. A seguito di velocità di sedimentazione, il gradiente è stato scaricato e il ribosoma Pro Tools LE è stato ottenuto. I dati sono stati registrati dal programma PeakTrak (gradiente di densità ISCO sistema gradiente di frazionamento). Le frazioni sono state raccolte, la proteina è stata TCA precipitata e ha deliberato 16,5% T, C 6% Tris-Tricine PAGE gel ^15. Il gel è stato essiccato ed esposto per autoradiografia. Dopo l'esposizione il gel è stato analizzato utilizzando Typhoon 9410 scanner imaging. La figura 2.1 mostra che il full-length Gamma-B sonoro superiore cristallino è presente in frazioni 70S dei ribosomi. Così, la sequenza SECM stallo consente l'isolamento della stalla bovina Gamma-B cristallina RNC. I dati in Figura 2,2 indicano chiaramente che i RNC isolate sono infatti stabili. Nell'esperimento corrente delle frazioni 70S dopo primo ciclo di centrifugazione gradiente di saccarosio sono state riunite e il saccarosio è stato rimosso usando Amicon Ultra-4 Unità di filtro centrifugo (Millipore), seguita da tampone scambio in soluzione contenente 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl _2, acetato di potassio 100 mM, DTT 1 mM. Questo campione è stato inoltre sottoposto ad una serie supplementare di centrifugazione attraverso gradiente 5-30% di saccarosio e frazionato. Ogni frazione è stata trattati ed analizzati come in Figura 2.1.

Discussione

Per risultati riproducibili, la qualità e la concentrazione dei componenti utilizzati per la trascrizione e traduzione in vitro sono critiche. Abbiamo usato commercialmente disponibile la trascrizione in vitro ed estratti di traduzione e danno risultati efficaci e riproducibili, se maneggiato con cura. Qualità di mRNA può influenzare la traduzione, quindi è della massima importanza per testare l'integrità di mRNA prima di utilizzarlo per traduzione in vitro. Il tempo di i...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente / Kit	Azienda	Numero di catalogo
MEGAscript T7 alta Kit Trascrizione rendimento	Ambion	AM1333
RTS 100 E.coli HY Kit	5 Prime	2401100
Ribonucleasi Inhibitor	Invitrogen	15518012
Trans [35 S]-Label	MP Biomedicals	0151006
Amicon Ultra-4 Unità centrifuga Filtro	Millipore	UFC801008
Stoccaggio fosforo autoradiografia	GE Healthcare	Typhoon 9410 imager modalità variabile
Gradiente di densità di frazionamento Sistemi	Teledyne Isco, Inc.	ISCO programmabile densità del sistema Gradient
Gradiente di saccarosio Centrifugation	Beckman Coulter	Optima L-90 K Preparative ultracentrifuga