Registrazione ottica di attività neurale suprathreshold con risoluzione singola cellula e single-picco

Sommario

Comprensione della funzione del sistema nervoso centrale dei vertebrati richiede registrazioni da molti neuroni perché funzione corticale pone a livello di popolazioni di neuroni. Qui si descrive un metodo ottico per registrare l'attività neurale suprathreshold con risoluzione di singola cellula e single-spike, dithering casuale scansione in accesso. Questo metodo registra somatiche segnali di calcio di fluorescenza da un massimo a 100 neuroni con alta risoluzione temporale. Un algoritmo di massima verosimiglianza deconvolves l'attività sottostante suprathreshold neurale dai segnali di calcio fluorescenza somatiche. Questo metodo rileva affidabile picchi con alta efficienza di rivelazione e un basso tasso di falsi positivi e possono essere utilizzati per studiare popolazioni neuronali In vitro E In vivo.

Abstract

Segnalazione di informazioni nel sistema nervoso centrale dei vertebrati sono spesso realizzate da popolazioni di neuroni anziché singoli neuroni. Anche propagazione dell'attività suprathreshold spiking coinvolge popolazioni di neuroni. Gli studi empirici riguardanti funzione corticale direttamente quindi richiedono registrazioni da popolazioni di neuroni ad alta risoluzione. Qui si descrive un metodo ottico e un algoritmo di deconvoluzione per registrare l'attività neurale da un massimo di 100 neuroni con risoluzione di singola cellula e single-picco. Questo metodo si basa sul rilevamento degli aumenti transitori delle concentrazioni di calcio intracellulare somatica associata a punte suprathreshold elettrici (potenziali d'azione) in neuroni corticali. Alta risoluzione temporale delle registrazioni ottiche viene raggiunto da un rapido accesso casuale tecnica di scansione utilizzando acusto-ottici deflettori (AOD) ^1. A due fotoni di eccitazione dei risultati di calcio-colorante sensibile in alta risoluzione spaziale in tis cerebrali opachicitare in giudizio ^2. Ricostruzione delle punte delle registrazioni di calcio fluorescenza viene raggiunto da un metodo di massima verosimiglianza. Simultanee registrazioni elettrofisiologiche e ottiche indicano che il nostro metodo rileva con sicurezza picchi (> 97% efficienza di rivelazione spike), ha un basso tasso di falsi positivi spike (<0,003 spikes / s), e una elevata precisione temporale (circa 3 ms) ^3. Questo metodo ottico di rilevazione spike può essere utilizzato per registrare l'attività neurale in vitro e in vivo in animali anestetizzati ^3,4.

Protocollo

1. Configurazione ottica (Figura 1)

1. Per eccitazione a due fotoni un sistema a infrarossi laser pulsato con impulsi a femtosecondi viene utilizzato. Un laser ad alta potenza di uscita (in alcuni casi> 2W a 890 nm) è necessario per compensare le perdite introdotte dai grandi componenti ottici del sistema.
2. Un sistema prechirper costituito da due prismi conferisce un negativo dispersione di velocità di gruppo (GVD) sulle impulsi laser prima delle acusto-ottici deflettori (AOD) per compensare la dispersione temporale introdotta dalla AOD ^1.
3. Due AOD con grandi aperture (10 mm per un obiettivo 40x immersione in acqua con NA 0,8) dev....

Discussione

Retinato ad accesso casuale la scansione rileva indirettamente attività suprathreshold spiking dagli aumenti del calcio intracellulare somatico associato ad ogni picco di un somata neurone. Gli aumenti di calcio intracellulare sono rilevati da coloranti fluorescenti di calcio. Le limitazioni di dithering accesso casuale scansione derivano principalmente dalla limitata del segnale-rumore dei segnali di fluorescenza del calcio. Il rapporto segnale-rumore è a sua volta limitato da fotodanneggiamento, che non consente di ut.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
			Componenti ottici sono elencati in ordine, partendo dal laser
Titan: Sapphire Laser	Coherent Inc.	Chameleon Ultra 2	Alta potenza di uscita consigliata (> 2W a 900 nm)
Lente acromatica f = 30 mm	Thor laboratori	AC254-030-B	Antiriflesso (AR) di rivestimento per 650-1050 nm
Lente acromatica f = 100 mm	Thor laboratori	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
lenti f = 75 mm	Thor laboratori	LA1608-B	AR 650-1050 nm
lenti f = 175 mm	Thor laboratori	LA1229-B	AR 650-1050 nm
Lente acromatica f = 300 mm	Thor laboratori	AC254-300-B	AR 650-1050 nm
Lente acromatica f = 100 mm	Thor laboratori	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
Lente acromatica f = 100 mm	Thor laboratori	AC254-100-B	AR 650-1050 nm
Acusto-ottico deflettori	Intraaction Corp	ATD 6510CD2
Diffrazione riflettente	Newport	53-011R	100 scanalature / mm per AOD con 65 MHz di larghezza di banda e l'angolo di scansione di 45 mrad
21,6 millimetri Brewster prismi	Lambda Research Optics Inc.	IBP21.6SF10
Vetro colorato	Schott	BG-39
Specchio dicroico	Chroma Technology Corp	Z532RDC
Fotomoltiplicatori moduli	Hamamatsu	H9305-03
DAC-ADC bordo	National Instruments	PCI-6115
Oregon verde 488-Bapta 01:00	Invitrogen	O-6807