Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Alla Gagarinova; Mohan Babu; Jack Greenblatt; Andrew Emili

doi:10.3791/4056

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Articolo metodologico

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di

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DOI:

10.3791/4056

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12 novembre 2012

Alla Gagarinova^*¹ , Mohan Babu^*²^,³ , Jack Greenblatt¹^,² , Andrew Emili¹^,²

¹Department of Molecular Genetics, University of Toronto, ²Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, ³Department of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Sistematiche e su larga scala di sintesi genetica (gene-gene o epistasi) schermi di interazione può essere utilizzato per esplorare la ridondanza genetica e via di cross-talk. Qui, descriviamo un high-throughput quantitativa sintetica genetica tecnologia di retinatura array, definito eSGA che abbiamo sviluppato per chiarire i rapporti epistatiche ed esplorare reti di interazione genetici in Escherichia coli.

Abstract

Fenotipi sono determinati da una serie complessa di fisica (ad esempio proteina-proteina) e funzionali (ad esempio gene-gene o genetico) interazioni (GI) ^1. Mentre interazioni fisiche in grado di indicare quali proteine batteriche sono associati come complessi, non necessariamente rivelano percorso a livello di relationships1 funzionali. GI schermi, in cui si misura la crescita dei doppi mutanti recanti due geni cancellati o inattivato e rispetto ai corrispondenti singoli mutanti, in grado di illuminare le dipendenze epistatiche tra loci e, quindi, fornire un mezzo per interrogare e scoprire nuove relazioni funzionali ^2. Mappe a grande scala GI sono stati riportati per gli organismi eucarioti, come lievito ^3-7, ma le informazioni GI rimangono sparse per procarioti ^8, che ostacola l'annotazione funzionale dei genomi batterici. A tal fine, noi e altri hanno sviluppato high-throughput quantitative batteriche metodi di screening GI ^{9, 10} Qui, presentiamo i passaggi chiave necessari per eseguire quantitativa E. coli sintetico Genetic Array (eSGA) Procedura di screening su un genoma scala ^9, utilizzando naturale coniugazione batterica e ricombinazione omologa per generare sistemica e misurare l'idoneità di un gran numero di doppi mutanti in un formato matrice colonia. Brevemente, un robot è utilizzato per trasferire , attraverso la coniugazione, cloramfenicolo (Cm) - segnato da alleli mutanti Hfr ingegneria (ad alta frequenza di ricombinazione) 'ceppi donatori in un array ordinato di kanamicina (Kan) - marcati F-destinatario ceppi. In genere, si usa la perdita di funzione singoli mutanti recanti non essenziali delezioni del gene (ad esempio, la collezione 'Keio' ¹¹⁾ e le mutazioni geniche essenziali hypomorphic alleli (cioè conferiscono ridotta espressione della proteina, la stabilità, o attività ^{9, 12, 13)} a interrogare le associazioni funzionali di geni non essenziali ed essenziali, resture rispettivamente. Dopo coniugazione mediata e conseguente scambio genetico mediante ricombinazione omologa, i mutanti risultanti doppie sono selezionati su terreno solido contenente entrambi gli antibiotici. Dopo conseguenza, le piastre vengono create digitalmente delle immagini e le dimensioni delle colonie sono quantitativamente valutato con un proprio sistema automatico di elaborazione delle immagini ^14. IG si rivelano quando il tasso di crescita di un doppio mutante o è significativamente migliore o peggiore del previsto ^9. Aggravanti (o negativo) GIS spesso il risultato tra la perdita-di-funzione mutazioni in coppie di geni provenienti da percorsi di compensazione che incidono sullo stesso processo essenziale ^2. Qui, la perdita di un singolo gene è tamponata, in modo tale che sia mutante singolo è praticabile. Tuttavia, la perdita di entrambi i percorsi è deleteria e provoca letalità sintetica o malattia (ovvero crescita lenta). Viceversa, alleviare (o positivo) possono verificarsi interazioni tra i geni della via stessa o proteina complessa ² comedelezione del gene o da solo è spesso sufficiente a perturbare la normale funzione della via o complesso tale che perturbazioni supplementari non ridurre l'attività, e quindi la crescita, ulteriormente. Nel complesso, l'identificazione sistematica e l'analisi delle reti GI in grado di fornire, località turistiche, mappe globali delle relazioni funzionali tra un gran numero di geni, da cui percorso informazioni a livello di perdere per altri approcci possono dedurre ^9.

Protocollo

1. Costruire HFR ceppi donatori Mutant Cavalli da Recombineering ^{15, 16}

I passi per costruire le macchie donatori eSGA sono descritti di seguito. In breve, usiamo λ mirata - Red mediata ricombinazione omologa ¹⁶ di cassette amplificato marcatore selezionabile frammenti di DNA generati da PCR per creare non essenziali mutanti di delezione del gene (punto 1.1) o di geni essenziali ceppi mutanti hypomorphic donatori (paragrafo 1.2), che vengono poi utilizzati come 'query' per definire le reti GI.

Nota: Durante il processo di sviluppo della tecnolog....