Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di Escherichia Coli Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Summary

Sistematiche e su larga scala di sintesi genetica (gene-gene o epistasi) schermi di interazione può essere utilizzato per esplorare la ridondanza genetica e via di cross-talk. Qui, descriviamo un high-throughput quantitativa sintetica genetica tecnologia di retinatura array, definito eSGA che abbiamo sviluppato per chiarire i rapporti epistatiche ed esplorare reti di interazione genetici in Escherichia coli.

Abstract

Fenotipi sono determinati da una serie complessa di fisica (ad esempio proteina-proteina) e funzionali (ad esempio gene-gene o genetico) interazioni (GI) ^1. Mentre interazioni fisiche in grado di indicare quali proteine ​​batteriche sono associati come complessi, non necessariamente rivelano percorso a livello di relationships1 funzionali. GI schermi, in cui si misura la crescita dei doppi mutanti recanti due geni cancellati o inattivato e rispetto ai corrispondenti singoli mutanti, in grado di illuminare le dipendenze epistatiche tra loci e, quindi, fornire un mezzo per interrogare e scoprire nuove relazioni funzionali ^2. Mappe a grande scala GI sono stati riportati per gli organismi eucarioti, come lievito ^3-7, ma le informazioni GI rimangono sparse per procarioti ^8, che ostacola l'annotazione funzionale dei genomi batterici. A tal fine, noi e altri hanno sviluppato high-throughput quantitative batteriche metodi di screening GI ^{9, 10} Qui, presentiamo i passaggi chiave necessari per eseguire quantitativa E. coli sintetico Genetic Array (eSGA) Procedura di screening su un genoma scala ^9, utilizzando naturale coniugazione batterica e ricombinazione omologa per generare sistemica e misurare l'idoneità di un gran numero di doppi mutanti in un formato matrice colonia. Brevemente, un robot è utilizzato per trasferire , attraverso la coniugazione, cloramfenicolo (Cm) - segnato da alleli mutanti Hfr ingegneria (ad alta frequenza di ricombinazione) 'ceppi donatori in un array ordinato di kanamicina (Kan) - marcati F-destinatario ceppi. In genere, si usa la perdita di funzione singoli mutanti recanti non essenziali delezioni del gene (ad esempio, la collezione 'Keio' ¹¹⁾ e le mutazioni geniche essenziali hypomorphic alleli (cioè conferiscono ridotta espressione della proteina, la stabilità, o attività ^{9, 12, 13)} a interrogare le associazioni funzionali di geni non essenziali ed essenziali, resture rispettivamente. Dopo coniugazione mediata e conseguente scambio genetico mediante ricombinazione omologa, i mutanti risultanti doppie sono selezionati su terreno solido contenente entrambi gli antibiotici. Dopo conseguenza, le piastre vengono create digitalmente delle immagini e le dimensioni delle colonie sono quantitativamente valutato con un proprio sistema automatico di elaborazione delle immagini ^14. IG si rivelano quando il tasso di crescita di un doppio mutante o è significativamente migliore o peggiore del previsto ^9. Aggravanti (o negativo) GIS spesso il risultato tra la perdita-di-funzione mutazioni in coppie di geni provenienti da percorsi di compensazione che incidono sullo stesso processo essenziale ^2. Qui, la perdita di un singolo gene è tamponata, in modo tale che sia mutante singolo è praticabile. Tuttavia, la perdita di entrambi i percorsi è deleteria e provoca letalità sintetica o malattia (ovvero crescita lenta). Viceversa, alleviare (o positivo) possono verificarsi interazioni tra i geni della via stessa o proteina complessa ² comedelezione del gene o da solo è spesso sufficiente a perturbare la normale funzione della via o complesso tale che perturbazioni supplementari non ridurre l'attività, e quindi la crescita, ulteriormente. Nel complesso, l'identificazione sistematica e l'analisi delle reti GI in grado di fornire, località turistiche, mappe globali delle relazioni funzionali tra un gran numero di geni, da cui percorso informazioni a livello di perdere per altri approcci possono dedurre ^9.

Protocol

1. Costruire HFR ceppi donatori Mutant Cavalli da Recombineering ^{15, 16}

I passi per costruire le macchie donatori eSGA sono descritti di seguito. In breve, usiamo λ mirata - Red mediata ricombinazione omologa ¹⁶ di cassette amplificato marcatore selezionabile frammenti di DNA generati da PCR per creare non essenziali mutanti di delezione del gene (punto 1.1) o di geni essenziali ceppi mutanti hypomorphic donatori (paragrafo 1.2), che vengono poi utilizzati come 'query' per definire le reti GI.

Nota: Durante il processo di sviluppo della tecnolog....

Results

GI rivelano relazioni funzionali tra i geni. Allo stesso modo, poiché i geni nello stesso percorso mostrano modelli gastrointestinali simili e la somiglianza del profilo gastrointestinale rappresenta la congruenza dei fenotipi, possiamo raggruppare geni funzionalmente correlati in percorsi raggruppando i loro profili gastrointestinali. L'integrazione delle reti di correlazione gastrointestinale e gastrointestinale con informazioni sull'interazione fisica o altri dati di associazione, come le relazioni del contesto genomi.......

Discussion

Abbiamo delineato un graduale protocollo per l'utilizzo di robot per studiare lo screening eSGA funzioni geniche batteriche a livello percorso interrogando GI. Questo approccio può essere utilizzato per studiare singoli geni sia interi sistemi biologici in E. coli. Cura l'esecuzione delle fasi sperimentali di cui sopra, tra cui tutti i controlli del caso, e rigorosamente in maniera indipendente l'analisi e la validazione dei dati GI sono aspetti chiave per il successo di eSGA nel fare nuove scoperte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibiotici
Cloramfenicolo	Bioshop	#CLR201
Kanamicina		#KAN201
Ampicillina		# AMP201
2. Luria-Bertani
LB in polvere	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Ceppi batterici e plasmidi
Hfr ceppo di cavalli λ red (JL238)	Babu et al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli Collezione di destinatari F-	BioResource Project (NBRP) del Giappone11
Hypomorphic E. coli F- ceppi di tag SPA	Biosistemi aperti; Babu et al.14
4. Primer
inneschi costanti dissalati a base di			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'Primer
		personalizzati dissalati	Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'Primer
			personalizzati dissalatiF2 e R2: regioni costanti 20 nt basate sulla sequenza pKD3 e 45 regioni di omologia personalizzate nt regione costante F2: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' regione costante R2: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 e S2: regioni costanti 27 nt per il priming dell'amplificazione della cassetta SPA-Cm e regioni di omologia personalizzate 45 nt regione costante S1: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' regione costante S2: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F e KOCO-C: 20 primer nt a 200 bp di distanza dal sito di delezione genica non essenziale o dal sito di inserimento del tag SPA del gene essenziale <
Taq DNA polimerasi	Fermentas	# EP0281
10X tampone PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Caricamento colorante	NEB	#B7021S
bromuro di etidio	Bioshop	# ETB444
10X tampone TBE	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Acido borico	Sigma	# T1503-1KG
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Sigma	# B6768-500G
Scala	DNA NEB	#N3232L
6. Kit di isolamento e purificazione del DNA
Kit di isolamento e purificazione del DNA genomico	Promega	#A1120
Kit Midi plasmidico	Qiagen	# 12143
Kit di purificazione QIAquick PCR	Qiagen	#28104
7. Apparecchiature per PCR, Trasformazione e Replica-pinning
Termociclatore	BioRad, iCycler
Elettroforesi su gel di agarosio	BioRad
Elettroporatore	Bio-Rad GenePulser II
0,2 cm cuvetta per elettroporazione	Bio-Rad
42 ° C agitatore a bagnomaria	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuga	Beckman Coulter
32 ° C agitatore	New Brunswick Scientific, Stati Uniti
32 Incubatore a piastre C	Fisher Scientific
robot da banco	Singer Instruments
96, 384 e 1.536 piazzole di densità dei pin	Singer Instruments
96 o 384 pin lunghi	Singer Instruments
8. Apparecchiature di imaging
Supporto per fotocamera	Kaiser
Fotocamera digitale, 10 megapixel	Any Vendor
Light boxes, unità Testrite 16" x 24"	Testrite
9. Tamponi o piastre Riciclaggio
10% candeggina	Qualsiasi fornitore
70% etanolo	Qualsiasi fornitore
Acqua distillata sterile	Qualsiasi fornitore Cappa
a flusso	Qualsiasi fornitore
Lampada a raggi ultravioletti	Qualsiasi fornitore
10. Articoli da laboratorio
50 ml provette in polipropilene	Any Vendor
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Any Vendor
Flak conici da 250 ml	VWR	# 29140-045
Provette sterili per colture da 15 ml	Thermo Scientific	# 366052
Fiale criogeniche	VWR	# 479-3221
Piastre rettangolari	Singer Instruments
Piastre per microtitolazione a 96 pozzetti e 384 pozzetti	Singer Instruments	Nunc
Plate roller per sigillare	Sigma	#R1275
	ABgene	# AB-0580
Guarnizioni adesive per piastre	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
° C congelatore	Qualsiasi fornitore