Un metodo per caricare zona subventricolare (SVZ) cellule con coloranti di calcio indicatori per l'attività di registrazione di calcio è descritto. Il post-natale SVZ contiene cellule ravvicinate comprese le cellule progenitrici neurali e neuroblasti. Piuttosto che utilizzare loading bagno abbiamo iniettato il colorante dalla pressione all'interno del tessuto consentendo una migliore diffusione colorante.
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Articolo metodologico
Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zona subventricolare (SVZ) è una delle due zone neurogenici nel cervello postnatale. La SVZ contiene cellule densamente, comprese le cellule progenitrici neurali con caratteristiche astrocitari (chiamati astrociti SVZ), neuroblasti, e cellule progenitrici intermedi. Neuroblasti nati nel SVZ tangenzialmente la migrazione di una grande distanza al bulbo olfattivo, dove si differenziano in interneuroni. Segnalazione intercellulari attraverso molecole di adesione e segnali diffusibili svolgono un ruolo importante nel controllo della neurogenesi. Molti di questi segnali innescare l'attività intracellulare di calcio che trasmette informazioni all'interno e tra le cellule. Attività calcio è così riflettente dell'attività di segnali extracellulari ed è un modo ottimale per comprendere funzionale segnalazione intercellulare tra cellule SVZ.
L'attività di calcio è stato studiato in molte altre regioni e tipi di cellule, tra cui gli astrociti e neuroni maturi. Tuttavia, il metodo tradizionale di loacellule d con indicatore colorante calcio (carico bagno ad esempio) non era efficiente al caricamento di tutti i tipi di cellule SVZ. Infatti, la densità cellulare nel SVZ osta diffusione colorante all'interno del tessuto. Inoltre, si preparano sezioni sagittali di preservare la disposizione tridimensionale delle cellule SVZ, in particolare il flusso di migrazione neuroblast sul rostrale-caudale asse.
Qui, descriviamo i metodi per preparare sezioni sagittali contenenti la SVZ, il caricamento delle cellule SVZ con colorante indicatore di calcio, e l'acquisizione delle attività di calcio con filmati time-lapse. Abbiamo usato Fluo-04:00 colorante per il caricamento di astrociti SVZ con applicazione di una pressione all'interno del tessuto. L'attività di calcio è stato registrato utilizzando un microscopio a scansione confocale che permette una risoluzione precisa per distinguere le singole celle. Il nostro approccio è applicabile ad altre zone neurogenici compresa la zona dell'ippocampo adulto subgranular embrionali e zone neurogena. Inoltre, altri tipi di coloranti possonoessere applicato utilizzando il metodo descritto.
Protocollo
1. Preparazione di soluzioni, Dissection, e vibratomo
- Soluzioni devono essere preparate al osmolarità corretto e pH (Tabella 1). Rispetto al fluido cerebrospinale artificiale (ACSF), dissezione soluzione viene preparata con concentrazioni minori di sodio e di calcio, e concentrazioni più elevate di magnesio. Questo per minimizzare gli effetti eccitotossicità durante l'affettatura.
- Entrambe le soluzioni dissezione e ACSF deve essere saturato con 95% O 2/5% di CO 2 per gorgogliamento per almeno 10 minuti per raggiungere il pH desiderato di 7,3.
- Preparare un bagno di ghiaccio in un vassoio. Posizionare un piatto dissezione nel bagno di ghiaccio e riempire con la soluzione dissezione. Bolla la piastra di dissezione.
- Preparare la vibratomo creando un bagno di ghiaccio. Porre la capsula di sezionamento nel bagno di ghiaccio, riempire il piatto con soluzione di dissezione, e bolla.
- Riempire la fetta tenuta camera con ACSF e bolla per garantire che la soluzione sia adeguatamente areato, indipendentementefette di dove sono posizionati.
2. La rimozione del tessuto cerebrale
Fettine di cervello acuti tendono ad essere più sano con i topi più giovani. L'architettura cellulare SVZ postnatale in roditori è maturo intorno al giorno post-natale (P) 20 1. Quindi, cerchiamo di limitare i nostri esperimenti per età del mouse di P20-P30, ma abbiamo effettuato esperimenti di successo in topi vecchie come 3 mesi. La manipolazione del tessuto, si deve prestare attenzione per minimizzare i movimenti meccanici e pressione al cervello, mantenere condizioni raffreddati, ed esporre la SVZ di soluzione il più rapidamente possibile sacrificio seguente.
- Dopo l'iniezione di pentobarbital, il mouse si sta rapidamente decapitato. Il pelo viene rimosso e le incisioni sono fatte attraverso la base del cranio. La testa viene poi posto in un vassoio riempito con soluzione di dissezione.
- Mentre stabilizzare la testa con una pinza, tagli continui sono fatti in tutto il cranio e, talvolta, la linea mediana con microscissors. Attenzione a minimizzare il contatto con il tessuto. Dal momento che il bulbo olfattivo è la destinazione finale dei neuroni neonati dalla SVZ, si deve essere consapevoli di preservare quella regione, in particolare durante la rimozione delle ossa intorno a questa zona. Microscissor tagli effettuati in tutto il cranio dovrebbe essere sul lato dorsale, per consentire una facile rimozione del cranio.
- Rimozione del cranio sovrastante il cervello è ora separato dalle ossa sotto il cervello. Se tagli nel passaggio precedente sono effettuate correttamente, questo osso sovrastante può essere rimosso facilmente con le pinzette o pinze.
- Tenendo ancora la testa con una pinza, si può utilizzare una lama chirurgica per rimuovere in modo pulito diversi pezzi di tessuto cerebrale prima affettatura, come il seguente. Un taglio coronale può essere fatta a livello di lambda. Tagli sagittali può essere effettuata su entrambi i lati del cervello laterale alla SVZ. Una stima prudente sarebbe ~ 2,5 mm dalla linea mediana. Se desiderato, il cervello può anche essere hemisected qui. Questi tagli saranno entrambi Facilitate montaggio del tessuto e consentono SVZ essere raggiunto più rapidamente quando il cervello affettatura. È importante ricordare di esercitare la quantità minima di forze meccaniche sul cervello (ad esempio non spingere o tirare).
3. Acuta del cervello Preparazione Slice
- Per preparare per passi successivi, in modo che la colla super utilizzato per montare il tessuto è libero di zoccoli e pronti ad applicare alla piastra vibratomo. È importante andare più veloce possibile senza danneggiare il cervello.
- Il tessuto cerebrale può essere scavato da sotto, che separa il tessuto dall'osso sottostante contemporaneamente separazione nervi.
- Il tessuto è montato ed incollato su un piatto e posizionato sul vibratomo. A causa della rostrale-caudale anatomia del SVZ, ci siamo concentrati sul rendere fette sagittali in quanto conserva il percorso migratorio dei neuroblasti, la guaina gliale, e il sistema vascolare, che sono in gran parte allineati in questa direzione. Si può sia mount il tessuto alla linea mediana o sulla superficie piana creata mediante tagli sagittali laterali al SVZ. Una fase opzionale è mettere un blocco 3% agarosio dietro il tessuto per servire da riscontro per la lama come le fette staccarsi. Si usa preferibilmente il cianoacrilato colla a base di super.
- Sciacquare la lama con etanolo per rimuovere oli e sciacquare con acqua distillata. Posizionare la lama sul portalama. Montare il portalama al vibratomo.
- Regolare le impostazioni vibratomo per tagliare il tessuto per uno spessore di 250-350 micron per fetta. È importante tagliare utilizzando vibrazioni ad alta frequenza e bassa velocità.
- Sezione progressivamente attraverso il tessuto. L'aspetto del bulbo olfattivo è un buon indicatore che si trova vicino SVZ in fette sagittali come le fette più laterali conterranno né regione. Altri punti di riferimento per cercare includere il ventricolo e l'ispessimento del corpo calloso, sotto il quale si trova la SVZ. La SVZ comparirà per primo nella più Sagit lateralefette mentali. Il RMS mostrerà in mediale fette sagittali.
- Togliere le fette contenenti il SVZ con una plastica pipetta Pasteur con la punta tagliata. Trasferimento alla camera di tenuta fetta. Spesso ottenere maggiori fette di quanto si possono utilizzare in un giorno di lavoro. Tuttavia, fette variano dalla quantità di cellule contenenti il SVZ. A volte è necessario guardare attraverso sezioni diverse per trovare quella desiderata per l'imaging.
4. Preparazione di Microscopio e Coloranti
Le fette richiedono un tempo di incubazione di un'ora in ACSF a riprendersi dalla dissezione e taglio. Diversi passaggi possono essere eseguite durante questo periodo di recupero slice.
- Preparazione di pipette per tintura di calcio e / o applicazione di droga
- Pipette di vetro devono avere una punta di 2-3 micron di diametro e una lunghezza della punta (~ 2 mm) e l'angolo (~ 16 ° per il titolare pipetta) che impedisce il contatto con la camera di perfusione e lascia spazio per il posizionamento deil'obiettivo.
- Si può preparare in genere 6-8 pipette di pressione per ogni giorno di esperimenti.
- Calcio colorante preparazione
- Quando si prepara la soluzione di lavoro (4-5 mM di bagno, 250 pM di applicazione di pressione), è preferibile esporre la quantità minima di DMSO alle cellule. Questo può essere ottenuto facendo scorte altamente concentrati. Per esempio, per Fluo-4, una provetta contenente 50 ug viene utilizzato al giorno. Si può fare uno stock 10 mM di tale aliquota con l'aggiunta di 4,6 ml di soluzione di Pluronic F-127, il 20% in DMSO.
- Preparazione configurazione microscopio (Figura 2).
- L'uso di una pompa peristaltica per il flusso di soluzione ha contribuito a minimizzare spostamento dell'immagine. Far funzionare la pompa peristaltica prima di consentire ACSF a correre attraverso le linee di perfusione e assicurarsi che sia priva di bolle.
- Impostare il tubo di ingresso della camera di perfusione e garantire non vi siano perdite.
- Posizionare il puntale vuoto per enteure che la soluzione viene aspirata dalla camera di perfusione. Assicurare che è a un livello adeguato in modo che l'obiettivo è immerso alla giusta distanza di lavoro, ma non così alta che tale soluzione può traboccare nella camera. Un basso livello di soluzione riducendo inoltre al minimo le distorsioni di flusso. Un costante aspirazione può anche essere verificata attraverso l'ascolto di stabilità.
5. Colorante di caricamento
Questo metodo è stato descritto in dettaglio in un altro manoscritto 2. Si prega di vedere le figure in esso.
- Bagno carico colorante
- Fare una soluzione 1-2 ml di lavoro del colorante. Per Fluo-4 AM, una concentrazione di 4-5 mM è sufficiente per etichettare neuroblasti SVZ.
- Fette vengono prima trasferiti in un piatto di coltura 35 mm, con fondo di rete che è già riempito con ACSF. Sostituire la soluzione utilizzando una pipetta di trasferimento 3 ml di plastica per rimuovere delicatamente il ACSF, contemporaneamente aggiungendo il calcium colorante soluzione di lavoro.
- Incubare a 37 ° C per 30-60 min in 5% CO 2 gas ambiente controllato.
- Mettere la fetta di nuovo nel pieno ACSF camera di contenimento per lavare via colorante che non ha inserito cellule. In alternativa, si può porre direttamente sulla camera di perfusione microscopio che esegue ACSF. Questo periodo di lavaggio è 30-45 min.
- Trasferire la sezione per la camera di perfusione.
- Applicazione della pressione di colorante
- Trasferire la fetta dalla camera di contenimento per la camera di perfusione della configurazione microscopio.
- Riempire una pipetta di vetro con una soluzione di lavoro che è di 250 pM e posto sul micromanipolatore.
- Abbassare la pipetta per la regione di interesse. La pipetta può essere posizionato in modo tale che la punta è o diversi micrometri dalla superficie di fetta o diversi micrometri sepolto sotto la superficie slice, ma lontano dalla regione registrata. L'angolo della pipetta non Affect l'efficienza di carico. Quando l'imaging sotto la superficie fetta, si scopre che mettendo la punta della pipetta di sotto del piano di imaging sarà etichettare la nostra area di esposizione desiderata meglio.
- Quando la pressione applicando il colorante, impostare il Picospritzer modo che sia <3 psi. Non abbiamo stimato il volume di diffusione colorante, perché questo è soggetto alla variabilità del diametro della punta della pipetta, la pressione applicata, e la densità del tessuto in cui viene iniettato il colorante. Noi applichiamo semplicemente fino a raggiungere il nostro carico desiderato, valutato a occhio. Minimizzare i danni alla slice durante l'applicazione, in particolare quando la punta è disposto sotto la superficie slice. La tua candidatura per 1-2 min. Applicazioni ripetute volte sono necessarie a seconda etichettatura come valutato a occhio. Per questo periodo di concentrazione e di applicazione, troviamo che l'applicazione della superficie di colorante etichetta preferenzialmente neuroblasti, mentre al di sotto della superficie di applicazione etichette preferenzialmente astrociti. Tuttavia,> 3 applicazione min a 500 pM anche etichettare neuroblastiindipendentemente dal fatto che la punta sia sopra o sotto la superficie di fetta (JC Platel, osservazioni non pubblicate). Lasciare per il lavaggio e il recupero fetta per 30-45 minuti.
6. Imaging confocale di attività di calcio
- Trova la regione di interesse prima con un obiettivo di risparmio energetico, come 4x o 10x. Posizionare nel centro del campo prima di passare a un obiettivo di potenza superiore. A questo punto, si può valutare la salute generale slice notando la comparsa di cellule SVZ in contrasto interferenziale differenziale (DIC). Le cellule sane appaiono rotondo e paffuto. Inoltre, le cellule sane visualizzerà debole Fluo-4 carico come suppone nessun carico a fluorescenza tutto o luminosi (una cellula morente).
- Abbassare l'immersione in acqua obiettivo sulla regione di interesse, che è ora colorante caricato. In entrambi i casi un obiettivo 40x o 60x è stata adeguata per le nostre esigenze, anche se 40x offre un campo visivo più ampio e consente di operare una maggiore pipetta. Quando l'imaging di sotto delsuperficie, andiamo spesso almeno 15 micron sotto la superficie slice in cui il 3-dimensionale architettura e la salute delle cellule sono meglio conservati.
- Verificare che la perfusione e di vuoto funzionano adeguatamente.
- Impostare il microscopio in modo che time-lapse risoluzione e risoluzione spaziale sono impostati su tassi desiderati. Per microscopia confocale, questi fattori devono essere bilanciati come un aumento della risoluzione temporale generalmente determina una perdita di risoluzione spaziale a causa della natura di scansione del sistema. Per l'attività di calcio, abbiamo immaginato una struttura di circa ogni secondo con una risoluzione di 512x512 pixel. Se più canali acquisite separatamente sono necessari, questo influirà anche velocità di acquisizione. Impostare la durata del film (2-10 min).
- Avviare l'esecuzione. Se si esegue studi di farmacologia, lavare il antagonisti o agonisti non desensibilizzanti per almeno 5-10 minuti, e poi fare un altro film di 5-10 min. Agonisti che possono desensibilizzare recettori possono essere acutamente applicata, ad esempio utilizzando un prEssure pipetta controllato da un micromanipolatore.
7. Analisi di calcio
Analisi segue procedure standard che abbiamo descritto in pubblicazioni permeabili 2-4. F 0 (cioè basale) e F sono le intensità media di fluorescenza misurati durante tutte le regioni di interesse (ROI) e in ogni ROI, rispettivamente. Un cambiamento di fluorescenza è stato considerato un aumento di Ca 2 + se era> 15% F / F 0 aumento. Intracellulare di Ca + 2 cambi sono stati calcolati utilizzando Calsignal 5.
8. Risultati rappresentativi
Siamo riusciti ad ottenere il caricamento selettivo di cellule SVZ seconda dei protocolli di carico colorante sopra descritti e altrove 2-4,6. Vasca di carico o di applicazione di pressione sulla superficie fetta di Fluo-04:00 (4-5 o 250 mM, rispettivamente) le etichette per lo più neuroblasti. Mentre applicazione di una pressione in grado di caricare neurobdura più rapidamente loading bagno in una sola fetta, carico vasca consente il caricamento simultaneo di più sezioni. Abbiamo confermare l'identità di cellule marcate come neuroblasti da (1) se visualizzare comportamento migratorio 4,7, (2) la loro morfologia, (3) colorazione negativa della sulforodamina 101, un astrociti specifico colorante 3 o (4) con colorazione positiva DCX-DsRed espressione (JC Platel, osservazioni non pubblicate). Neuroblasti migrano rapidamente (media di 60 pm / h) a temperatura fisiologica 4,7-9, ma il loro movimento può essere facilmente osservato anche a temperatura ambiente. Il movimento dei neuroblasti non pone un problema per quanto riguarda l'immissione regioni d'interesse (ROI) per monitorare l'attività di calcio in quanto i nostri film sono in genere di breve durata. Tuttavia, durante i lunghi periodi di attesa, come ad esempio durante lo scambio di soluzioni di droga, gli investigatori devono fare attenzione in modo che corrisponda ROI sotto controllo e periodi di trattamento. Non è raro che neuroblasti migrare dentro o fuori della i MAGING campo o piano focale.
Applicazione della pressione di Fluo-4 AM (250 pm) in profondità nella sezione e per la durata limitata (<2 min) etichetta preferenzialmente astrociti SVZ 2. Etichettatura astrociti è stata verificata mediante l'etichettatura positiva con solforodamina 101 e la loro morfologia, soprattutto per la presenza di proiezioni e endfeet sui vasi sanguigni, che abbiamo recentemente descritto 3. Usando questi metodi, abbiamo osservato attività spontanea sia nella popolazione neuroblast SVZ e astrociti (Figura 1). L'attività in astrociti spesso assume la forma di onde che svolgono recipiente 3 sanguigno. Inoltre, utilizzando l'imaging calcio come un saggio, l'applicazione di agonisti farmacologici ha rivelato o confermata espressione di recettori GABA sul neuroblasti e astrociti 6, AMPA e NMDA recettori neuroblasti 4.
Cifre
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Figura 1. Attività di moltiplicazione di calcio negli astrociti. (A) Rappresentante in media immagine da un time-lapse di attività calcio. Astrociti nella SVZ stati caricati con applicazione di pressione di Fluo-4 sono profondo nella slice. Film sono stati acquisiti a 0,75 s di tempo passi. Regioni di interesse (ROI) sono disposti sopra le cellule che presentano attività. (B) Tracce di ROI posizionata sopra cellule del film illustrato in (A). Tracce sono stati filtrati con una media mobile e normalizzato. La scala verticale rappresenta 2 x Af / F 0 dove F è l'intensità del segnale e F 0 è il segnale basale media e Af = 0 FF.
Figura 2. Immagine del sistema di perfusione. Un'estremità di un tubo viene immerso in 95% O 2/5% CO 2 gas-psoluzione erfused. La soluzione è quindi perfuso attraverso il tubo e alla camera bagno da una pompa peristaltica (non mostrato). L'altra estremità è inserita nella presa soluzione della camera vasca montata su una piattaforma. La punta di aspirazione viene quindi collegato all'uscita soluzione della camera e fissato ad un livello per determinare l'altezza soluzione. Dalla presa, la punta di aspirazione è collegato alla linea del vuoto, che aspira la soluzione dalla camera in un contenitore per rifiuti. Il sistema di perfusione è indicata dal palco microscopio per maggiore chiarezza visiva.
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Discussione
Immagini di calcio delle cellule SVZ è stato utilizzato per studiare gli schemi di attività spontanea in neuroblasti 10, canale di espressione del recettore in entrambi i neuroblasti e astrociti 4,6,8 e onde di calcio astrocitari 3. Poiché le cellule del SVZ o sono immaturi o hanno proprietà gliali, non sparare potenziali di azione 11,12, il che significa che i cambiamenti millisecondo potenziale tensione indicativa di attività in reti maturi non è applicabile in questa region...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH (DC007681, AB), CT cellule staminali di assegnazione (AB), Pardee fondazione (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein Nazionale Research Service Awards (NRSA) (SZY), e un NSF Graduate Research Fellowship (BL). Ringraziamo i membri del laboratorio Bordey per gli utili commenti sul manoscritto. Il materiale presente è basata su un lavoro in parte sostenuto da parte dello Stato del Connecticut sotto la ricerca sulle cellule staminali Connecticut programma di sovvenzioni. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dello Stato del Connecticut, del Dipartimento di Sanità Pubblica dello Stato del Connecticut o TC Innovations, Incorporated.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluto | Azienda | Numero di catalogo | Dissezione (mM) |
| Saccarosio | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mm ACSF: 0 mm |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mm ACSF: 126 mm |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl 2 .6 H 2 O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH 2 PO 4. H 2 O | Sigma | S8282 | Dissection: 1,25 mm ACSF: 1,25 mm |
| Glucosio | Sigma | G8270 | DisseZIONE: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO 3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mm ACSF: 26 mm |
| CaCl 2 .2 H 2 O | Sigma | C3306 | Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM |
Tabella 1. Lista Chimica e ricette di soluzione di dissezione e ACSF.
| [Intestazione] | |||
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Vibratomo | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold o 3M | Surehold 3G Super Glue o 3M Vet-Bond | |
| Dissezione strumenti | Roboz o Ted Pella | ||
| Fluo-04:00 calcio colorante sensibile | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon verde BAPTA-1:00 calcio-colorante sensibile | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 soluzione 20% in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Montante microscopio confocale | Olimpo | FV300 o FV1000 | |
| Immersione in acqua obiettivi | Olimpo | LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) | |
| Micromanipolatori | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Regolatore di pressione | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI durante l'applicazione |
| Pipettare estrattore | Sutter o Narshige | Sutter P-97 o Narshige PP-830 | |
| Pipette di vetro | Sutter | BF150-110-10 | ID: 1.10, OD: 1.50 |
| Pompa peristaltica | Harvard Apparatus | Modello 720 | Portata: 1 ml / min |
| Camera da bagno | Warner Instruments | RC-26 GLP | A basso profilo consente di attestazione obiettivo |
| Tubi | Tygon | ||
| Termoregolatore | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Tabella 2. Materiali / dotazioni.
Riferimenti
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- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
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