Un metodo di trasferimento genico in embrioni di pollo in fasi successive di incubazione (più di Hamburger e Hamilton stadio (HH) 22) è descritto. Questo metodo supera inconvenienti In ovo applicata a embrioni di pollo anziani ed è una tecnica utile per studiare la funzione regolazione dei geni e alle vecchie stadi di sviluppo.
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Articolo metodologico
Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'embrione di pollo fornisce un ottimo sistema modello per studiare la funzione del gene e la regolazione durante lo sviluppo embrionale. In elettroporazione ovo è un metodo efficace per geni esogeni over-espressa o down-regolare i geni endogeni in vivo in embrioni di pollo 1. Di strutture diverse come i geni codificanti del DNA plasmidi 2-4, piccoli RNA interferenti (siRNA) 5 plasmidi, piccoli RNA sintetico oligos 6 e 7 morpholino oligonucleotidi antisenso può essere facilmente trasfettati in embrioni di pollo mediante elettroporazione. Tuttavia, l'applicazione di elettroporazione in ovo è limitata a embrioni nelle fasi iniziali di incubazione (meno di stage HH20 - in base ad Amburgo e Hamilton) 8 e ci sono alcuni svantaggi per la sua applicazione in embrioni in fasi successive (più vecchio di stage HH22 - circa 3,5 giorni di sviluppo). Ad esempio, la membrana vitellina in fasi successive è solitamentealleato attaccato alla membrana deve e aprendo una finestra nel guscio provoca la rottura dei vasi, con conseguente morte degli embrioni; vecchi embrioni sono coperti da navi vitellina e allantoico, dove è difficile accedere e manipolare gli embrioni; vecchi embrioni spostare vigorosamente ed è difficile controllare l'orientamento attraverso una finestra relativamente piccola nel guscio.
In questo protocollo si dimostra un metodo di elettroporazione ex ovo per il trasferimento del gene in embrioni di pollo nelle fasi tardive (di età superiore a stage HH22). Per elettroporazione ex ovo, gli embrioni vengono coltivati in piastre di Petri 9 e il vitellino e vasi allantoide sono ampiamente diffuse. In queste condizioni, gli embrioni di pollo anziani sono facilmente accessibili e manipolati. Pertanto, questo metodo supera gli svantaggi della elettroporazione in ovo applicata ai vecchi embrioni di pollo. Utilizzando questo metodo, plasmidi possono essere facilmente trasfettato in parti differentidegli embrioni di pollo anziani 10-12.
Protocollo
1. Cultura Ex ovo
- Freschi uova fecondate sono stabiliti sul loro lato lungo in un forzata progetto incubatore (BSS160, Ehret, Germania) a 37,5 ° C con 60% di umidità per l'incubazione. Uova conservati a 12 ° C per più di una settimana non dovrebbe essere usato.
- Dopo incubazione per 2,5 giorni (circa fase HH17), estrarre le uova ed etichettare la parte superiore con una matita per indicare la direzione per il cracking.
- Prima di cracking, versare circa 20 ml di acqua distillata sterile in un grande piatto pulito Petri (diametro di 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Germania).
- Posizionare un altro piccolo piastra di Petri....
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Discussione
Questo protocollo fornisce una guida per il trasferimento del gene in embrioni di pollo grandi (ad esempio, nel tetto ottico a E6) di elettroporazione ex ovo. Questo metodo estende l'utilizzo di elettroporazione di embrioni di pollo anziani e può essere facilmente applicato a molti laboratori per lo studio della funzione genica in vivo in fasi successive. Gli embrioni da E4 ad almeno E7 può essere successo elettroporate con questo metodo e gli embrioni possono essere elettroporate sopravvivenza fin.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione per la ricerca tedesco (DFG, LU1455/1-1).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | |
| Elettroporatore | Nepa Gene, Giappone | CUY21-Edit | |
| Elettrodi | Nepa Gene, Giappone | CUY661-3x7 | |
| Egg incubatore | Ehret, Germania | BSS160 | |
| Embryo incubatore | BINDER GmbH, Germany | ||
| Microscopio a fluorescenza | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri | Greiner Bio-One GmbH, Germania | ||
| Microelettrodo puller | Mondiale strumenti di precisione, Germania | PUL-100 |
Riferimenti
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C.
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Ristampe e permessi
