Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

Summary

Questo protocollo permette di identificare fattori che modulano funzionale massa delle cellule beta per trovare potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del diabete. Il protocollo consiste in un metodo semplificato per valutare la replicazione delle isole e la funzione delle cellule beta in isole di ratto isolati dopo manipolazione genica con adenovirus.

Abstract

Omeostasi del glucosio è principalmente controllata dal sistema endocrino gli ormoni insulina e glucagone, secreto dal pancreas beta e le cellule alfa, rispettivamente. Functional massa di cellule beta è determinata dalla massa anatomica cellule beta così come la capacità delle cellule beta per rispondere a un carico di nutrienti. Una perdita di massa funzionale delle cellule beta è fondamentale per entrambe le forme principali di diabete ^1-3. Considerando che i risultati in declino funzionale massa di cellule beta da un attacco autoimmune nel diabete tipo 1, diabete di tipo 2, questo decremento si sviluppa sia da una incapacità delle cellule beta di secernere insulina in modo appropriato e la distruzione delle cellule beta da una squadra di meccanismi. Pertanto, gli sforzi per ristabilire la massa funzionale delle cellule beta sono di primaria importanza al trattamento migliore e potenziali cure per il diabete.

Gli sforzi sono in corso per identificare i meccanismi molecolari che possono essere sfruttate per stimolare la replicazione e migliorare la funzione delle cellule beta.Idealmente, gli obiettivi terapeutici potrebbe migliorare sia la crescita e la funzione delle cellule beta. Forse ancora più importante però è quello di identificare se una strategia che stimola la crescita delle cellule beta arriva al costo di compromettere la funzione delle cellule beta (come nel caso di alcuni oncogeni) e viceversa.

Sistematicamente la soppressione o sovraespressione l'espressione di geni bersaglio in isole isolate di ratto, si possono identificare potenziali bersagli terapeutici per aumentare la massa funzionale delle cellule beta ^4-6. I vettori adenovirali possono essere impiegati per proteine ​​efficiente esprimono molti o smontabile in isole di ratto isolati ^4,7-15. Qui, presentiamo un metodo per modificare l'espressione genica utilizzando trasduzione adenovirale e valutare la replicazione e la funzione delle cellule insulari beta in isole di ratto isolati (Figura 1). Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per identificare nuovi bersagli che modulano la replicazione delle cellule beta o una funzione ^{5,6,8,9,16,17.}

Protocol

1. Trasduzione adenovirale e la coltura di isole di ratto

1. Preparare una ben 6-non-tessuto piastra rivestita coltura aggiungendo 2 ml di mezzo (RPMI 1640 contenente 8 mM di glucosio, 10% di siero fetale bovino, 50 unità / ml di penicillina, e 50 ug / ml di streptomicina) al numero richiesto di pozzi. Ad esempio, un tipico esperimento può richiedere tre pozzetti, uno per ogni mancato controllo virus, un controllo virus (ad esempio, GFP-esprimono adenovirus), e il gruppo sperimentale.
2. Riscaldare la piastra a 37 ° C ponendo in un incubatore di coltura tissutale per almeno 30 min.
3. Immediatamente dopo isolotto isolamento ratto ^18,19,

Discussion

Stabilire percorsi che possono essere modulate per stimolare la replicazione e migliorare la funzione delle cellule beta sono importanti per entrambe le forme principali di diabete. Poiché funzionale massa di cellule beta dipende dalla esistenza e la funzione di cellule che secernono insulina, valutando questi determinanti simultaneamente ha i suoi vantaggi. Questo protocollo descrive un protocollo semplificato per identificare se la sovraespressione o la soppressione di una proteina porta a variazioni di massa funziona.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
RPMI 1640 mezzi	Gibco	11879
Penicillina / streptomicina	Gibco	15140
6-pozzetti	BD-Falcon	35-1146	Non-TC trattati
[Metil-3 H]-timidina	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi / ml
Micro-provette da centrifuga;	Denville	C2170	1,7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH 2 </ Sub> PO 4	Acros	20592
MgSO 4	Acros	41348
CaCl 2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	Soluzione 1 M
35% BSA	Sigma	A7979
NaHCO 3	Acros	42427
d-glucosio	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% w / v
NaOH	Acros	12426
Scintillazione tubo	Sarstedt	58,536	7 ml, PP
Scintillazione tappo del tubo di conteggio	Sarstedt	65,816
Econo-Safe cocktail di conteggio	RPI	111175
Insulina RIA	Siemens	TKIN2
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	23250
			Attrezzatura
Centrifuga	Eppendorf	5415R
Scintillazione portaprovette	Sarstedt	93.1431.001
Contatore a scintillazione liquida	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR