Articolo metodologico

La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell'ipossia sulla C. elegans

DOI:

10.3791/4088

⸱

20 luglio 2012

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Washington, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

In questo articolo

Sommario

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Questo paper come utilizzare camere di ipossia a flusso continuo per generare atmosfere con concentrazioni definite di O 2 Per capire le risposte biologiche a una riduzione dei O 2. Questo sistema è facile da installare e mantenere, e sufficientemente flessibile per adattarsi ad una vasta gamma di O 2 Concentrazioni e sistemi modello

Abstract

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L'ossigeno è essenziale per tutti i metazoi per sopravvivere, con una sola eccezione nota 1. Diminuzione O 2 disponibilità (ipossia) possono sorgere durante gli stati di malattia, sviluppo normale o variazioni delle condizioni ambientali 2-5. Comprendere le vie di segnalazione cellulare che sono coinvolti nella risposta all'ipossia potrebbe fornire una nuova visione strategie terapeutiche per diverse patologie umane, da ictus al cancro. Questo obiettivo è stato impedito, almeno in parte, le difficoltà tecniche connesse con l'esposizione controllata ipossica in organismi modello geneticamente suscettibili.

Il nematode Caenorhabditis elegans è ideale come organismo modello per lo studio della risposta ipossica, come è facile alla cultura e manipolare geneticamente. Inoltre, è possibile studiare le risposte cellulari a specifici ipossiche O 2 concentrazioni senza effetti confondenti da C. elegans ottenere O 2 (e altri gas) per diffusione, in contrapposizione ad un sistema respiratorio facilitato 6. Fattori note per essere coinvolte nella risposta ad ipossia sono conservati in C. elegans. La reale risposta al ipossia dipende dalla concentrazione specifica di O 2 che è disponibile. In C. elegans, l'esposizione a moderare l'ipossia provoca una risposta trascrizionale mediata in gran parte da HIF-1, i altamente conservate ipossia-inducibile fattore di trascrizione 6-9. C. elegans. embrioni richiedono HIF-1 per sopravvivere in 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . L'ipossia è un termine generico per "inferiore al normale O 2". Normossia (normale O 2) può anche essere difficile da definire. In genere consideriamo aria della stanza, che è 210.000 ppm O 2 per essere normossia. Tuttavia, è stato dimostrato che C. elegans ha una preferenza comportamentale per le concentrazioni di O 2 da 5-12% 50,000-120,000 ppm (O 2) 11. In larvae e adulti, HIF-1 agisce per prevenire l'ipossia indotta diapausa in ppm O 5000 2 12. Tuttavia, HIF-1 non gioca un ruolo nella risposta a concentrazioni più basse di O 2 (anossia, definizione operativa <10 ppm O 2) 13. In anossia, C. elegans entra in uno stato reversibile di animazione sospesa, in cui tutte le attività microscopicamente osservabile cessa 10. Il fatto che le diverse risposte fisiologiche si verificano in condizioni diverse evidenzia l'importanza di avere il controllo sperimentale sulla concentrazione di O 2 ipossica.

Qui, viene presentato un metodo per la realizzazione e la realizzazione di camere ambientali che producono condizioni di ipossia affidabili e riproducibili con concentrazioni definite di O 2. Il metodo flusso continuo assicura un rapido equilibrio della camera e aumenta la stabilità del sistema. Inoltre, la trasparenza el'accessibilità delle camere permettono la visualizzazione diretta di animali esposti a ipossia. Si illustra, inoltre, un efficace metodo di raccolta C. elegans campioni rapidamente dopo l'esposizione a ipossia, che è necessario osservare molte delle rapidamente invertiti cambiamenti che si verificano in ipossia 10,14. Questo metodo fornisce un fondamento di base che può essere facilmente modificato per esigenze di laboratorio individuali, compresi i sistemi di modelli diversi e una varietà di gas.

Protocollo

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1. Costruzione di camere ambientali

  1. Selezionare il più piccolo volume ragionevole di camera richiesta per l'ambito del progetto. Sezione deve essere fatta di gas (O 2) materiale impermeabile. Piatti cristallizzazione Pyrex, scatole Anaeropack o grandi cast-acrilici scatole (Ellard Instrumentation), possono essere utilizzati. Abbiamo scoperto che 9 50 piastre mm possono andare bene in un piatto x 100 50 cristallizzazione Kimex. Lastre di vetro possono essere usati come coperchi per piatti di cristallizzazione Pyrex.
  2. Praticare un foro nella camera selezionata e montare con un maschio di plastica al raccordo Luer Portagomma (Cole Parmer).....

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Discussione

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Questo metodo presenta una strategia per la costruzione di un ambiente ipossico che consente di ambienti con precise concentrazioni di ossigeno per essere mantenute in laboratorio. Queste camere di fornire un metodo semplice per esporre organismi a specifiche concentrazioni basse di O 2 e di controllo delle uscite molecolari e fisiologiche. La camera ambientale descritta è assemblato da laboratorio invece acquistabile e può quindi essere modificata per adattarsi alle esigenze dell'esperimento.

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Dichiarazioni

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i membri del laboratorio di Miller per la discussione e lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un premio nuovo investigatore del Centro Shock Nathan di Eccellenza nella biologia di base di invecchiamento DLM e il National Institutes of award Salute R00 AG030550 di DLM.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo
Tubi (FEP e PTFE) Cole Parmer
Tygon 		YO-95821-00 (1/8 "FEP)
06.605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) 'R-3603
Raccordi a compressione Seattle Fluid Systems 06.363-58 (M. accoppiatore 1/16 ")
06.363-62 (F. accoppiatore 1/16 ")
06.363-60 (M. accoppiatore 1/8 ")
06.363-61 (F. accoppiatore 1/8 ")
Tubo di passaggio Aalborg PMR3-010073 (3 uscite)
PMR1-013520 (1 uscita)
Controllore di flusso di massa Sierra Instruments 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak)
C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)
Serbatoio di gas compresso Airgas Su ordinazione
Plastic Luer maschio per raccordi portagomma Cole Parmer 45505-41 (serie 500 1/16 ")
Cast scatole acrilici Ellard Strumentazione Su ordinazione
Raccordi (ottone o acciaio inox) Seattle Fluid Systems B-402-1 (1/4 "dado)
B-200-3 (1/8 "raccordo a T)
B-400-set (1/4 "boccole)
B-QM2-B1-200 (QC Corpo QM)
B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "maschio conn)
Dow Corning vuoto Grease Sigma-Aldrich Z273554
AnaeroPack box Misubishi Gas Chemical Company R684004 (0,4 litri)
R685025 (2,5 litri)
R685070 (7,0 litri)
Pyrex gas Bottiglia per il lavaggio Sigma-Aldrich CLS31770500C (500 mL)
CLS31770250C (250 mL)
CLS31770125C (125 mL)
L'acido palmitico Sigma-Aldrich P0500
Capra anti-topo IgG-perossidasi di rafano Southern Biotechnology Associates 1032-1005
SuperSignal Ovest Pico substrato Chemiluminsecent Pierce Chemical 34077
100 x 50 piatti in vetro di cristallizzazione Kimax Kimble 23000

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
  2. Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....

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