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Articolo metodologico

La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell'ipossia sulla

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⸱

DOI:

10.3791/4088

⸱

20 luglio 2012

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Washington, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington

In questo articolo

Sommario

Questo paper come utilizzare camere di ipossia a flusso continuo per generare atmosfere con concentrazioni definite di O 2 Per capire le risposte biologiche a una riduzione dei O 2. Questo sistema è facile da installare e mantenere, e sufficientemente flessibile per adattarsi ad una vasta gamma di O 2 Concentrazioni e sistemi modello

Abstract

L'ossigeno è essenziale per tutti i metazoi per sopravvivere, con una sola eccezione nota 1. Diminuzione O 2 disponibilità (ipossia) possono sorgere durante gli stati di malattia, sviluppo normale o variazioni delle condizioni ambientali 2-5. Comprendere le vie di segnalazione cellulare che sono coinvolti nella risposta all'ipossia potrebbe fornire una nuova visione strategie terapeutiche per diverse patologie umane, da ictus al cancro. Questo obiettivo è stato impedito, almeno in parte, le difficoltà tecniche connesse con l'esposizione controllata ipossica in organismi modello geneticamente suscettibili.

Il nematode Caenorhabditis elegans è ideale come organismo modello per lo studio della risposta ipossica, come è facile alla cultura e manipolare geneticamente. Inoltre, è possibile studiare le risposte cellulari a specifici ipossiche O 2 concentrazioni senza effetti confondenti da C. elegans ottenere O 2 (e altri gas) per diffusione, in contrapposizione ad un sistema respiratorio facilitato 6. Fattori note per essere coinvolte nella risposta ad ipossia sono conservati in C. elegans. La reale risposta al ipossia dipende dalla concentrazione specifica di O 2 che è disponibile. In C. elegans, l'esposizione a moderare l'ipossia provoca una risposta trascrizionale mediata in gran parte da HIF-1, i altamente conservate ipossia-inducibile fattore di trascrizione 6-9. C. elegans. embrioni richiedono HIF-1 per sopravvivere in 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . L'ipossia è un termine generico per "inferiore al normale O 2". Normossia (normale O 2) può anche essere difficile da definire. In genere consideriamo aria della stanza, che è 210.000 ppm O 2 per essere normossia. Tuttavia, è stato dimostrato che C. elegans ha una preferenza comportamentale per le concentrazioni di O 2 da 5-12% 50,000-120,000 ppm (O 2) 11. In larvae e adulti, HIF-1 agisce per prevenire l'ipossia indotta diapausa in ppm O 5000 2 12. Tuttavia, HIF-1 non gioca un ruolo nella risposta a concentrazioni più basse di O 2 (anossia, definizione operativa <10 ppm O 2) 13. In anossia, C. elegans entra in uno stato reversibile di animazione sospesa, in cui tutte le attività microscopicamente osservabile cessa 10. Il fatto che le diverse risposte fisiologiche si verificano in condizioni diverse evidenzia l'importanza di avere il controllo sperimentale sulla concentrazione di O 2 ipossica.

Qui, viene presentato un metodo per la realizzazione e la realizzazione di camere ambientali che producono condizioni di ipossia affidabili e riproducibili con concentrazioni definite di O 2. Il metodo flusso continuo assicura un rapido equilibrio della camera e aumenta la stabilità del sistema. Inoltre, la trasparenza el'accessibilità delle camere permettono la visualizzazione diretta di animali esposti a ipossia. Si illustra, inoltre, un efficace metodo di raccolta C. elegans campioni rapidamente dopo l'esposizione a ipossia, che è necessario osservare molte delle rapidamente invertiti cambiamenti che si verificano in ipossia 10,14. Questo metodo fornisce un fondamento di base che può essere facilmente modificato per esigenze di laboratorio individuali, compresi i sistemi di modelli diversi e una varietà di gas.

Protocollo

1. Costruzione di camere ambientali

  1. Selezionare il più piccolo volume ragionevole di camera richiesta per l'ambito del progetto. Sezione deve essere fatta di gas (O 2) materiale impermeabile. Piatti cristallizzazione Pyrex, scatole Anaeropack o grandi cast-acrilici scatole (Ellard Instrumentation), possono essere utilizzati. Abbiamo scoperto che 9 50 piastre mm possono andare bene in un piatto x 100 50 cristallizzazione Kimex. Lastre di vetro possono essere usati come coperchi per piatti di cristallizzazione Pyrex.
  2. Praticare un foro nella camera selezionata e montare con un maschio di plastica al raccordo Luer Portagomma (Cole Parmer). Raccordi possono essere garantiti da raccordo o con resina epossidica. Installare un raccordo simile sul lato opposto del contenitore per consentire al gas di fluire dentro e fuori della camera. Se possibile, compensare i fori per aumentare la miscelazione turbolenta.
  3. Ottenere serbatoi di gas compressi con definiti O 2 concentrazioni (bilanciato con N 2) che sono certificati standard per O 2 content o, per condizioni anossiche, puro N 2 (<10 ppm O 2). Utilizzare commutazione automatica regolatori per studi a lungo termine per evitare di compromettere i livelli di ossigeno nelle camere.
  4. Risposta organica all'ipossia ha dimostrato di essere dipendente dalla temperatura 15. Inserendo la camera in un incubatore, temperature differenti può essere mantenuta. Le temperature all'interno di un incubatore può essere irregolare e come tale, è prudente fare uso di un registratore di dati di temperatura per misurare costantemente la temperatura all'interno della camera.

2. Collegamento del gas per la camera ambientale

  1. Per tutte le connessioni, utilizzare un ottavo-pollici esterno-diametro del tubo collegato con dei connettori a scatto o raccordi a compressione. Tubi deve essere impermeabile e non reattivo con O 2, come etilene propilene fluorurato (FEP) o nylon (Cole Parmer). Per uno schema della configurazione completata, vedi Figura 1.
  2. Collegare il comserbatoi premuto in un dispositivo di controllo del flusso, ad esempio un controllore di flusso di massa (Sierra Instruments) o rotametro (Aalborg). Assicurarsi che la pressione a monte del serbatoio è entro la portata del dispositivo di flusso ed i raccordi a gomito. Due stadi regolatori sono generalmente utilizzati, con la seconda fase impostato la pressione desiderata [Vedere la sezione tre per la selezione del tasso adeguato flusso]
  3. Idrato il gas da gorgogliare attraverso acqua distillata utilizzando una bottiglia di lavaggio con gas cilindro poroso, poi diretta in uno dei raccordi sulla camera ambientale, lasciando il secondo raccordo aperto per gas di scarico (vedi figura 1). Per studi a breve termine, l'idratazione gas protegge essiccazione piatto, ma il monitoraggio dell'umidità può essere necessario per studi a lungo termine.
  4. Dow Corning grasso vuoto può essere usato per sigillare la camera. Pesi di luogo sul coperchio della camera di garantire una tenuta ermetica. Per confermare una perfetta tenuta ed un adeguato flusso, tenere una piccola pozza d'acqua nel palmo della yla mano guantata al raccordo sulla camera e verificare la presenza di bolle.

3. Selezione Portata

  1. Supponendo perfetta miscelazione, non vi è scambio di gas 90% dell'atmosfera gassosa ogni volta che si sostituisce il volume della camera (legge di Fick). Ad esempio, in una camera 100 cc con una portata di 100 cc / min, l'aria casa originale nella camera sarà sostituito con il 90% del gas desiderato dopo 1 minuto, e si avvicinano asintoticamente cambio completo del 90% ogni minuto successivamente.
  2. Portate superiori e piccoli contenitori raggiungeranno la concentrazione di ossigeno desiderata più rapidamente. Per 100 x 50 Kimex contenitori (400 cc), una portata di 120 cc / min raggiungerà il 99,9% in 10 minuti scambio (scambi 3). Tale portata è adatto per la maggior parte delle condizioni di ossigeno. A nostra conoscenza non vi è stato uno studio sistematico di come il tasso di variazione della concentrazione di O 2 influenza la risposta in C. elegans.

4. Preparazione dei campioni per l'analisi di vitalità

  1. Worms esposti a condizioni di ipossia comunemente sfuggire alla superficie delle piastre di agar. Per evitare ciò, posizionare un anello di acido palmitico (10 mg / ml in etanolo) attorno al bordo delle lastre. L'acido palmitico uscirà soluzione evapora etanolo, formando una barriera fisica. Barriere acido palmitico non influiscono tasso di deposizione delle uova, fecondità o la durata della vita in C. elegans 16,17. Burrowing non si verifica più frequentemente in condizioni di ipossia, le misure preventive in modo supplementari non sono generalmente richiesti.
    1. Genera popolazioni sincronizzati da sbiancamento adulti gravide in una piccola goccia di soluzione di candeggina non teste di serie alcalina nematodi crescita dei media (NGM) piastre 18. A differenza dei tradizionali grandi lotti protocolli ipoclorito sbiancanti, raccogliere 1-100 animali in una goccia di soluzione di candeggina sulla superficie di una piastra NGM, quindi consentire la soluzione di candeggina per assorbire nella piastra 18. Dopo almeno 12 ore, trasferire le larve L1 sincronizzato con piastre seminate con vivo OP50 batteri. In alternativa, si può consentire agli adulti gravide per deporre le uova sulla piastra per 2-3 ore di generare un gruppo di vermi che si svilupperà in modo sincrono o raccogliere le larve L4 da una popolazione mista.
    2. Evitare di esporre embrioni sbiancato di ipossia, in quanto ciò può ridurre la vitalità 13. Per raccogliere embrioni giovani (2-4 cellule), gli adulti gravide può essere tagliato in un piccolo volume di acqua con una lama di rasoio e gli embrioni si trasferisce a piastre pipettare bocca per una successiva esposizione all'ipossia.
  3. Sigillare le piastre nella camera ambientale. Gli animali di controllo devono essere tenuti in normossia (casa aria) alla stessa temperatura come vermi trattati. Non c'è alcuna differenza osservabile tra i campioni rimasti in casa aria e quelli mantenuti in una camera identica a casa l'aria che scorre su di loro. Avviare il flusso di gas e mantenere l'esposizione per il tempo desiderato. Per garantire l'uniformità in rampa, assicuratevi disostituire l'acqua nella bottiglia del gas di lavaggio prima dell'esposizione.
  4. Per la sopravvivenza degli embrioni test, permettono di sviluppare i vermi per 48 ore dopo il ritorno in aria ambiente, a quel punto dovrebbero essere quarta fase delle larve / giorno uno adulti. Punteggio per la sopravvivenza, censura i vermi che non possono essere contabilizzate.
  5. Per visualizzare animali esposti ad ipossia, spostare i vermi ad una goccia di M9 su un 22 mm 2 coprioggetto, e capovolgere su un blocco di agarosio al 2% in M9 18. Se necessario, levamisolo (25 mM) o di sodio azide (10 mM) può essere utilizzato come anestetico. Azide di sodio e levamisolo può confondere alcune osservazioni a causa della tossicità e dovrebbe essere usato con giudizio 19.

5. Harvest rapida di ipossia esposti a Worms (Esempio: Preparazione dei campioni per HIF-1 Analisi occidentale)

Molti ipossia effetti indotti sono rapidamente invertito al rientro in aria ambiente, compresa la ripresa della produzione di uova 12, la fosforilazione di epitopi mitotichein embriogenesi 13 e degradazione della proteina HIF-1 9,20. Isolamento rapido degli animali esposti a ipossia è necessario per ottenere effetti riproducibili in queste condizioni. Con questa configurazione, gli animali possono essere raccolti e congelati in azoto liquido in meno di due minuti. Mentre guanto camere ipossia box consentono la manipolazione dei campioni in condizioni anossiche, il loro costo e praticità per condizioni diverse da anossia limitare la loro utilità.

  1. Grow Bristol vermi N2 su 4 10 cm ad alta crescita (HG) piastre fino la maggioranza dei vermi adulti sono gravide 18. Lavare vermi ad un tubo 15 ml contenente una soluzione alcalina candeggina 1:5 e incubare con rotazione fino vermi inizia a dissolversi, non più di 5 minuti 9. Lavare i vermi tre volte con M9, riducendo la velocità a 1500 xg tra ogni lavaggio senza frenatura.
  2. Embrioni piastra sbiancato su 8 150 piastre NGM mm e permettono di sviluppare per le larve L4 (~ 48 ore per Bristol N2 a 22 ° C).Spostare le piastre di camere per prove ambientali e di esporre a ipossia (1.000 ppm, 5000 ppm) e anossiche (N2) le condizioni per 4 ore. I tempi di esposizione variano a seconda del modello sperimentale. Mentre l'esposizione all'ipossia ha un effetto immediato sul tasso di deposizione delle uova, due embrioni di cellule muoiono dopo 16-18 ore di esposizione 12. Con questa configurazione camera di ipossia, il limite inferiore di esposizione è vincolata dal tasso di cambio atmosfera necessaria per raggiungere l'equilibrio.
  3. Etichettare una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e un tubo di 15 ml per ogni campione sperimentale. Worms esposti a ipossia è più probabile che aderisca alle pareti del tubo durante la raccolta. Per evitare questo, posto 100 pl di solfato di sodio 1% dodecil (SDS) in ogni provetta 15 mL conico. Se SDS inibisce applicazioni a valle, albumina di siero bovino (BSA) può essere utilizzato per evitare che si attacchi. L'uso routinario di SDS o BSA non sembra avere una differenza apparente. Aggiungere 50 pl di colorante 2x proteina di carico (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanolo etraccia di blu di bromofenolo in 30% glicerolo (w / v)) per il tubo per microcentrifuga 1,5 ml. Avere un Dewar di azoto liquido pronto.
  4. Ora i passi dopo aver rimosso i vermi da ipossia e record. Togliere il coperchio della camera ipossica, prendere un piatto del campione, e richiudere la camera. Usare acqua distillata per lavare i vermi su un filtro di nylon e poi versare nel tubo di 15 ml. Spin i vermi verso il basso in una centrifuga desktop a 1500 xg per 15-20 secondi con freno.
  5. Utilizzare un vuoto per rimuovere la maggior parte del surnatante dal tubo, lasciando intatto il verme pellet.
  6. Usando una pipetta, spostare il verme pellet in 50 microlitri al tubo microcentrifuga 1,5 ml. Sigillare il tubo e immergere in azoto liquido.
  7. Ripetere fino a quando tutti i campioni sono stati isolati. Seguire queste procedure per la casa di campioni di controllo dell'aria per coerenza. I campioni possono essere conservati a -20 ° C.

6. Risultati rappresentativi

Organismal effetti dell'ipossia può essere vistoesaminando la vitalità fino all'età adulta di C. elegans (Figura 2). Gli embrioni di cui da wild-type Bristol (N2) e HIF-1 (IA04) mutanti di delezione sono tutti a sopravvivere in casa aria concentrazioni di O 2 (210.000 ppm O 2). N 2 worm sono in grado di adattarsi e sopravvivere fino all'età adulta in 5000 ppm O 2, mentre HIF-1 embrioni non sono vitali. Ciò dimostra che HIF-1 è essenziale per adattarsi al cambiamento dei livelli di ossigeno disponibile nell'ambiente 10. Né N2 né HIF-1 gli animali possono sopravvivere l'esposizione a 1000 ppm O 2.

Visualizzazione verme direttamente in ipossia è possibile con l'uso di un ambito dissezione e contenitore trasparente (Figura 3). Con direttamente ponendo la camera ipossia sulla portata dissezione, non vi è alcuna necessità di rimuovere i vermi da ipossia osservare reazioni organismi. La portata può essere dotato illumation fluorescenza (come in figura 3 ), estendendo ulteriormente i tipi di osservazioni in ipossia che sono possibili.

figure-protocol-1
Figura 1. Esempio di ipossia camera. Direzione del flusso di gas è indicata dalle frecce. Il gas è stoccato in serbatoi di gas compresso con definite concentrazioni di O 2 (1) e un regolatore di due fasi è collegato (2). Gas entra nella parte inferiore del tubo di flusso (3), esce dalla parte superiore alla portata corretta. Gas quindi fluisce nel pallone bolla (4), idratante il gas (garantire il corretto collegamento del pallone bolla osservando bolle). Idrato gas passa poi nella camera di ipossia alla valvola di afflusso (5), esponendo i campioni a ipossia. Il gas infine aperture nella camera attraverso un foro di scarico praticato nella camera.

figure-protocol-2
Figura 2. La vitalità degli embrioni esposti a 1000 ppm O 2, 5000 ppm O 2 e normossia (~ 210.000 ppm O 2). Embrioni sono stati esposti a condizioni ciascuno di ossigeno come embrioni per 24 ore in camere di flusso continuo di ossigeno. Worms sono stati spostati verso condizioni di normossia, ha permesso di sviluppare verso l'età adulta per 48 ore, e poi ha segnato per la vitalità fino all'età adulta. n> 50, N = 5.

figure-protocol-3
Figura 3. Visualizzazione di C. elegans in ipossia con il microscopio. Worms sono esposti all'ipossia utilizzando i metodi descritti. La camera di trasparenza ambientale (realizzato con un piatto di cristallizzazione e lastra di vetro pyrex) è posizionato direttamente sul palcoscenico di un ambito dissezione. Due punti di vista sono mostrati, uno tra il flusso di gas intero set up, l'altra con solo la camera sul palco microscopio.

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Discussione

Questo metodo presenta una strategia per la costruzione di un ambiente ipossico che consente di ambienti con precise concentrazioni di ossigeno per essere mantenute in laboratorio. Queste camere di fornire un metodo semplice per esporre organismi a specifiche concentrazioni basse di O 2 e di controllo delle uscite molecolari e fisiologiche. La camera ambientale descritta è assemblato da laboratorio invece acquistabile e può quindi essere modificata per adattarsi alle esigenze dell'esperimento.

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Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio di Miller per la discussione e lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un premio nuovo investigatore del Centro Shock Nathan di Eccellenza nella biologia di base di invecchiamento DLM e il National Institutes of award Salute R00 AG030550 di DLM.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo
Tubi (FEP e PTFE) Cole Parmer
Tygon 		YO-95821-00 (1/8 "FEP)
06.605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) 'R-3603
Raccordi a compressione Seattle Fluid Systems 06.363-58 (M. accoppiatore 1/16 ")
06.363-62 (F. accoppiatore 1/16 ")
06.363-60 (M. accoppiatore 1/8 ")
06.363-61 (F. accoppiatore 1/8 ")
Tubo di passaggio Aalborg PMR3-010073 (3 uscite)
PMR1-013520 (1 uscita)
Controllore di flusso di massa Sierra Instruments 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak)
C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)
Serbatoio di gas compresso Airgas Su ordinazione
Plastic Luer maschio per raccordi portagomma Cole Parmer 45505-41 (serie 500 1/16 ")
Cast scatole acrilici Ellard Strumentazione Su ordinazione
Raccordi (ottone o acciaio inox) Seattle Fluid Systems B-402-1 (1/4 "dado)
B-200-3 (1/8 "raccordo a T)
B-400-set (1/4 "boccole)
B-QM2-B1-200 (QC Corpo QM)
B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "maschio conn)
Dow Corning vuoto Grease Sigma-Aldrich Z273554
AnaeroPack box Misubishi Gas Chemical Company R684004 (0,4 litri)
R685025 (2,5 litri)
R685070 (7,0 litri)
Pyrex gas Bottiglia per il lavaggio Sigma-Aldrich CLS31770500C (500 mL)
CLS31770250C (250 mL)
CLS31770125C (125 mL)
L'acido palmitico Sigma-Aldrich P0500
Capra anti-topo IgG-perossidasi di rafano Southern Biotechnology Associates 1032-1005
SuperSignal Ovest Pico substrato Chemiluminsecent Pierce Chemical 34077
100 x 50 piatti in vetro di cristallizzazione Kimax Kimble 23000

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