Abbiamo sviluppato un sistema di tassi di video-microscopio di monitoraggio in grado di registrare e quantificare C. elegans ad alta risoluzione e velocità elevate. Abbiamo anche sviluppato metodi computazionali per ridurre la dimensionalità dei vermi immagini ad un insieme fondamentale di misurazioni che descrivono completamente la forma del verme.
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Articolo metodologico
C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato tecniche di analisi della strumentazione, elaborazione delle immagini, e dati per quantificare il comportamento motorio di C. elegans come striscia sulla superficie di una piastra di agar. Per lo studio della genetica, basi biochimiche, e neuronali del comportamento, C. elegans è un organismo ideale perché è geneticamente trattabile, suscettibili di microscopia, e mostra un certo numero di comportamenti complessi, compresi i taxi, di apprendimento, e 1,2 interazione sociale. Analisi comportamentale basata sul monitoraggio dei movimenti di vermi che strisciano sulle piastre di agar sono stati particolarmente utili nello studio del comportamento sensoriale 3, locomozione 4, e la fenotipizzazione generale mutazionale 5. Il nostro sistema funziona spostando il sistema di telecamere e illuminazione come i vermi striscia su una piastra di agar stazionaria, che garantisce l'assenza di stimolo meccanico viene trasmessa alla vite senza fine. Sistema di tracciamento è facile da usare e comprende un semi-automatico funzione di calibrazione. Un challenge di video di tutti i sistemi di inseguimento è che genera una quantità enorme di dati che è intrinsecamente dimensionale. Nostra elaborazione delle immagini e programmi di analisi dei dati affrontare questo problema riducendo la forma vermi in un insieme di componenti indipendenti, che globalmente ricostruire il comportamento vermi come funzione di solo dimensioni 3-4 6,7. Come esempio del processo si dimostra che il verme entra ed esce allo stato inversione in maniera specifica fase.
Protocollo
1. Descrizione del Microscopio monitoraggio
- Una piastra di agar è illuminato da una sorgente di luce in fibre e ripreso con una telecamera. Questo sistema è montato un, traduzione Y X stadio.
- Lo stadio è mosso da motori passo-passo standard, che sono collegati ad un controllore motore passo-passo.
- Il controllore e fotocamera sono collegati al computer e controllati da programmi personalizzati scritti in LabVIEW.
- La telecamera le immagini della superficie di una piastra di agar e identifica gli oggetti scuri su sfondo chiaro.
- La qualità dell'immagine viene regolata in modo che il programma di computer può quantificare oggetti in tempo reale. Il guadagno, la luminosità e la velocità dell'otturatore della fotocamera può essere regolato per fornire un oggetto scuro su uno sfondo bianco.
- Un segno di calibrazione per la calibrazione automatica è fatta colpendo la superficie dell'agar con un pick verme.
- Il filtrato, immagine binaria che viene utilizzato dal programma di monitoraggio può essere controllato.
- Il modoftware dispone di una funzione di auto-calibrazione che calcola la matrice di calibrazione con lo spostamento di un oggetto di prova una distanza fissa.
- Distanze in pixel è calibrato per azioni intraprese dal motore passo-passo per la matrice di calibrazione.
- Dopo la calibrazione, il sistema è pronto per andare e non necessita di essere ricalibrata meno che l'ingrandimento viene modificato oppure se la telecamera viene riposizionata.
2. Preparazione di piatti di monitoraggio e C. elegans per il monitoraggio
- Un anello di rame è usato per all'angolo i vermi e mantenere la loro migrazione verso il bordo della lastra. Il rame fornisce una barriera chimica locale e non influenza il movimento del verme altrimenti per la durata dell'esperimento (<1 ora). Riscaldare il primo anello appoggiandolo su un blocco di calore o equivalente.
- Anello posto su una piastra di agar fresco (1,7% Agar Bacto, 0,25% Bacto-peptone, 0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM tampone fosfato di potassio, 5 pg / mlcolesterolo) e premere leggermente verso il basso per incorporare nella superficie dell'agar.
- Molto L4 stadio o vermi adulti giovani su una piastra di agar riempito con qualche tampone NGM (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM tampone fosfato di potassio) per lavarli di residui di cibo. Lasciate che i vermi nuotare per qualche minuto.
- Posizionare con cura un verme solo sulla piastra di inseguimento nei pressi del centro del ring. E poi la piastra sul tracker worm.
3. Worm monitoraggio
- Eseguire il programma LabVIEW e selezionare le opzioni, se necessario (percorso per immagini, tipi di immagini, misure, impostazioni della fotocamera).
- Utilizzando il joystick spostare il microscopio fino un'immagine del verme è nel campo di visualizzazione (monitor). Premere "traccia" per attivare il programma di monitoraggio.
- Il programma di computer misura effettivamente i movimenti di un immagini binarie filtrati come illustrato e possono effettuare misurazioni su questa immagine in tempo reale
- A poppaer inseguimento una ricostruzione della traiettoria globale può essere fatto dai movimenti del motore passo-passo, mentre le variazioni di forma locali della vite senza fine può essere visto in dettaglio.
4. Analisi dei dati
- Esegui script skeletonizing (MATLAB) per parametrizzare le forme del worm. (Figura 2)
- Calcolare modi di vibrare dei dati scheletrato. (Figure 3,4)
- Mostra Figura 5. Leggi leggenda figura o risultati rappresentativi.
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Risultati
Esempio: Quando foraggiamento, C. transizioni elegans da avanti a indietro movimento, spesso l'esecuzione di un nuovo orientamento (omega giro) prima di tornare allo stato di avanzamento. Quantificare questo passaggio è importante per la comprensione dei modelli di foraggiamento di movimento e anche nel controllo motorio del worm. Il potere di rivelare i dettagli sottili di comportamento locomozione può essere visualizzato utilizzando il nostro dispositivo tracker.
A ti...
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Discussione
Lo studio della locomozione e il comportamento naturale richiede tecniche di rilevamento non invasive nei paesi partner e con le tecniche di riduzione dei dati. Qui abbiamo dimostrato un facile da usare sistema di tracciamento che registra le immagini dettagliate di C. elegans comportamento come striscia sulla superficie di una piastra di agar. La quantità di informazioni contenute in queste immagini è vasto e alto-dimensionali, e così abbiamo anche sviluppato metodi per ridurre la dimensionalità dei dati in so...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome della parte | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Telecamera CCD | Basler | A601f | |
| Lente | Edmund Optics | MMS serie | |
| Illuminazione a fibre | Dolan Jenner | DC-950H | |
| Traduzione fase | Deltron | LS3-4 | |
| Motore passo-passo | US digitale | MS23C | |
| Passo-passo motore | Geco | G201 | |
| Motore passo-passo di controllo | SimpleStep | SSXYZ | |
| Tutto il codice di programmazione è disponibile. Si prega di inviare una email di richiesta al autore corrispondente. |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
