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I metodi di incapsulamento microfluidico sono stati precedentemente utilizzati per catturare cellule in gocce acquose monodisperse su scala picoliter, fornendo il confinamento da un ambiente fluido di massa con applicazioni in screening ad alto rendimento, citometria e spettrometria di massa. Descriviamo un metodo non solo per incapsulare singole cellule, ma per catturare ripetutamente un determinato numero di cellule (qui dimostriamo l'incapsulamento di una e due cellule) per studiare sia l'isolamento che le interazioni tra le cellule in gruppi di dimensioni controllate. Combinando le tecniche di generazione di gocce con l'ordinamento di celle e particelle, dimostriamo l'incapsulamento controllato di particelle di dimensioni cellulari per un incapsulamento efficiente e continuo. Utilizzando una sospensione acquosa di particelle e olio fluorocarbonico immiscibile, generiamo gocce acquose in olio con un ugello di focalizzazione del flusso. La portata acquosa è sufficientemente elevata da creare un ordine di particelle che raggiungono l'ugello a frequenze multiple intere della frequenza di generazione delle gocce, incapsulando un numero controllato di celle in ogni goccia. Per risultati rappresentativi, vengono utilizzate particelle di polistirene da 9,9 μm come surrogati cellulari. Questo studio mostra un'efficienza di incapsulamento a singola particella Pk=1 dell'83,7% e un'efficienza di incapsulamento a doppia particella Pk=2 del 79,5% rispetto alle rispettive efficienze di Poisson del 39,3% e del 33,3%, rispettivamente. L'effetto di una concentrazione costante di celle e particelle si è dimostrato di grande importanza per un incapsulamento efficiente e vengono affrontate anche le transizioni dal gocciolamento al getto.
Introduzione
Le sospensioni di cellule acquose con mezzi continui condividono un ambiente fluido comune che permette alle cellule di interagire in parallelo e omogeneizza anche gli effetti di cellule specifiche nelle misurazioni dai mezzi. L'incapsulamento ad alto rendimento delle cellule in gocce su scala picoliter confina i campioni per proteggere le gocce dalla contaminazione incrociata, consentire una misura della diversità cellulare all'interno dei campioni, prevenire la diluizione dei reagenti e dei biomarcatori espressi e amplificare i segnali dei prodotti del bioreattore. Le gocce forniscono anche la capacità di riunire le gocce in campioni acquosi più grandi o con altre gocce per studi di segnalazione intercellulare. 1,2 La riduzione della diluizione implica segnali di rilevamento più forti per misure di maggiore accuratezza, nonché la capacità di ridurre i volumi di campioni e reagenti potenzialmente costosi. 3 L'incapsulamento delle cellule in gocce è stato utilizzato per migliorare il rilevamento dell'espressione proteica,4 degli anticorpi,5,6 degli enzimi,7 e dell'attività metabolica 8 per lo screening ad alto rendimento e potrebbe essere utilizzato per migliorare la citometria ad alto rendimento. 9 Ulteriori studi presentano applicazioni nella bio-elettrospruzzatura di celle contenenti gocce per la spettrometria di massa10 e rivestimenti mirati di celle superficiali. 11 Alcune applicazioni, tuttavia, sono state limitate dalla mancanza di capacità di controllare il numero di cellule incapsulate nelle gocce. Qui presentiamo un metodo di incapsulamento ordinato12 che aumenta l'efficienza di incapsulamento dimostrata per una e due celle e può essere estrapolato per l'incapsulamento di un numero maggiore di cellule.
Per ottenere la generazione di gocce monodisperse, la "focalizzazione del flusso" microfluidica consente la creazione di gocce di dimensioni controllabili di un fluido (una miscela di celle acquose) all'interno di un altro (una fase oleosa continua) utilizzando un ugello in cui i flussi convergono. 13 Per una data geometria dell'ugello, la frequenza di generazione delle gocce f e la dimensione delle gocce possono essere modificate regolando le portate dell'olio e dell'acqua Qolio e Qaq. All'aumentare delle portate, i flussi possono passare dalla generazione di gocce al getto instabile di fluido acquoso dall'ugello. 14
Quando la soluzione acquosa contiene particelle sospese, le particelle vengono incapsulate e isolate l'una dall'altra all'ugello. Per la generazione di gocce utilizzando una sospensione acquosa di cellule distribuita in modo casuale, la frazione media di gocce Dk contenenti k cellule è dettata dalla statistica di Poisson, dove Dk = λk exp(-λ)/(k!) e λ è il numero medio di cellule per goccia. La frazione di cellule che finiscono nelle gocce "correttamente" incapsulate viene calcolata utilizzando Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). La sottile differenza tra le due metriche è che Dk si riferisce all'utilizzo del fluido acquoso e alla quantità di smistamento delle gocce che deve essere completata dopo l'incapsulamento, e Pk si riferisce all'utilizzo del campione di cellule. Ad esempio, si potrebbe utilizzare una sospensione cellulare diluita (a basso λ) per incapsulare gocce in cui la maggior parte delle gocce contenenti cellule conterrebbe una sola cellula. Mentre la metrica di efficienza Pk sarebbe elevata, la maggior parte delle gocce sarebbe vuota (D k bassa), richiedendo quindi un meccanismo di smistamento per rimuovere le gocce vuote, riducendo anche la produttività. 15
Combinando la generazione di gocce con l'ordinamento inerziale, si ottiene la possibilità di incapsulare gocce con un numero più prevedibile di celle per goccia e un throughput più elevato rispetto all'incapsulamento casuale. La focalizzazione inerziale è stata scoperta per la prima volta da Segre e Silberberg16 e si riferisce alla tendenza delle particelle di dimensioni finite a migrare verso posizioni di equilibrio laterale nel flusso del canale. L'ordinamento inerziale si riferisce alla tendenza delle particelle e delle celle a organizzarsi passivamente in treni a velocità costante equidistanti e sfalsati. Sia la focalizzazione che l'ordinamento richiedono portate sufficientemente elevate (alto numero di Reynolds) e dimensioni delle particelle (alto numero di Reynolds). 17,18 Qui, il numero di Reynolds Re =uDh/ν e il numero di Reynolds particella Rep =Re(a/Dh)2, dove u è una velocità caratteristica del flusso, Dh [=2wh/(w+h)] è il diametro idraulico, ν è la viscosità cinematica, a è il diametro della particella, w è la larghezza del canale e h è l'altezza del canale. Empiricamente, la lunghezza richiesta per ottenere treni completamente ordinati diminuisce all'aumentare di Re e Rep. Si noti che gli elevati requisiti di Re e Rep (per questo studio rispettivamente dell'ordine di 5 e 0,5) possono entrare in conflitto con la necessità di mantenere basse le portate acquose per evitare getti sull'ugello di generazione delle gocce. Inoltre, portate elevate portano a sollecitazioni di taglio più elevate sulle celle, che non sono affrontate in questo protocollo. Il precedente studio di incapsulamento ordinato ha dimostrato che oltre il 90% delle cellule HL60 incapsulate singolarmente in condizioni di flusso simili a quelle di questo studio ha mantenuto l'integrità della membrana cellulare. 12 Tuttavia, l'effetto dell'entità e delle scale temporali delle sollecitazioni di taglio dovrà essere attentamente considerato quando si estrapolano diversi tipi di celle e parametri di flusso. La sovrapposizione dei vincoli di ordine delle cellule, generazione di gocce e velocità di flusso acquoso della vitalità delle cellule fornisce un regime operativo ideale per l'incapsulamento controllato di celle singole e multiple.
Poiché pochissimi studi affrontano la spaziatura tra i treni interparticellari,19,20 determinare la spaziatura è più facile da fare empiricamente e dipenderà dalla geometria del canale, dalla portata, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione delle particelle. Tuttavia, l'uguale spaziatura laterale tra i treni implica che le celle arrivino a intervalli di tempo prevedibili e coerenti. Quando la generazione di gocce avviene alla stessa velocità con cui le cellule ordinate arrivano all'ugello, le cellule vengono incapsulate all'interno della goccia in modo controllato. Questa tecnica è stata utilizzata per incapsulare singole celle con velocità di trasmissione dell'ordine di 15 kHz,12 un miglioramento significativo rispetto a studi precedenti che riportavano tassi di incapsulamento dell'ordine di 60-160 Hz.4,15 Nel lavoro di incapsulamento controllato, oltre l'80% delle gocce conteneva una e una sola cellula, un significativo miglioramento dell'efficienza rispetto alle statistiche di Poisson (casuali), che prevede un'efficienza media inferiore al 40%. 12
In precedenti lavori di incapsulamento controllato,12 il numero medio di particelle per goccia λ è stato regolato per fornire l'incapsulamento a singola cellula. Ipotizziamo che attraverso la regolazione delle velocità di flusso, possiamo incapsulare in modo efficiente qualsiasi numero di cellule per goccia quando λ è uguale o vicino al numero di cellule desiderate per goccia. Mentre l'incapsulamento a singola cellula è prezioso per determinare le risposte delle singole cellule dagli stimoli, l'incapsulamento a più cellule fornisce informazioni relative all'interazione di numeri e tipi di cellule controllati. Qui presentiamo un protocollo, risultati rappresentativi utilizzando microsfere di polistirene e discussione per l'incapsulamento controllato di più celle utilizzando un canale di ordinamento inerziale passivo e un ugello di generazione di gocce.