High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento

Sommario

Combinando goccia generazione monodisperse con ordinamento inerziale di cellule e particelle, si descrive un metodo per incapsulare un numero desiderato di celle o particelle in una singola goccia a tassi kHz. Abbiamo dimostrato efficienze due volte superiori a quelli di incapsulamento non ordinate per raccogliere le gocce singola e doppia-particelle.

Abstract

I metodi di incapsulamento microfluidico sono stati precedentemente utilizzati per catturare cellule in gocce acquose monodisperse su scala picolitrica, fornendo un confinamento rispetto a un ambiente fluido in massa, con applicazioni nell'analisi ad alto rendimento, citometria e spettrometria di massa. Descriviamo un metodo che permette non solo di incapsulare singole cellule, ma anche di catturare ripetutamente un numero definito di cellule (in questo caso dimostriamo l'incapsulamento di una e due cellule) per studiare sia l'isolamento che le interazioni tra cellule in gruppi di dimensioni controllate. Combinando tecniche di generazione di gocce con l'ordinamento di cellule e particelle, dimostriamo un incapsulamento controllato di particelle di dimensioni cellulari per un incapsulamento efficiente e continuo. Utilizzando una sospensione acquosa di particelle e un olio fluorocarbonico immiscibile, generiamo gocce acquose in olio mediante un ugello a focalizzazione del flusso. La portata del flusso acquoso è sufficientemente elevata da creare un ordinamento delle particelle che raggiungono l'ugello a frequenze multiple intere della frequenza di generazione delle gocce, incapsulando un numero controllato di cellule in ciascuna goccia. Per risultati rappresentativi, vengono utilizzate particelle di polistirene da 9,9 μm come surrogati cellulari. Questo studio mostra un'efficienza di incapsulamento di singola particella P_k=1 del 83,7% e un'efficienza di incapsulamento di doppia particella P_k=2 del 79,5%, rispetto alle rispettive efficienze di Poisson del 39,3% e del 33,3%. Si dimostra che la costanza della concentrazione di cellule e particelle è di fondamentale importanza per un incapsulamento efficiente, e vengono inoltre trattate le transizioni da gocciolamento a getto.

Introduzione

Le sospensioni cellulari acquose in mezzi continui condividono un ambiente fluido comune che permette alle cellule di interagire in parallelo e omogeneizza gli effetti di cellule specifiche nelle misurazioni effettuate sul mezzo. L'incapsulamento ad alto rendimento delle cellule in gocce su scala picolitro isola i campioni proteggendoli dalla contaminazione incrociata, consente di valutare la diversità cellulare all'interno dei campioni, evita la diluizione di reagenti e biomarcatori espressi e amplifica i segnali provenienti dai prodotti dei bioreattori. Le gocce offrono inoltre la possibilità di riunire gocce in campioni acquosi più grandi o con altre gocce per studi sulle comunicazioni intercellulari.^1,2 La riduzione della diluizione implica segnali di rilevamento più intensi, consentendo misurazioni più accurate, nonché la possibilità di ridurre volumi di campione e reagenti potenzialmente costosi.³ L'incapsulamento di cellule in gocce è stato utilizzato per migliorare il rilevamento dell'espressione proteica,⁴ degli anticorpi,^5,6 degli enzimi,⁷ e dell'attività metabolica⁸ nell'ambito dello screening ad alto rendimento, e potrebbe essere impiegato per migliorare la citometria ad alto rendimento.⁹ Altri studi illustrano applicazioni nell'elettrospray bioanalitico di gocce contenenti cellule per spettrometria di massa¹⁰ e rivestimenti cellulari superficiali mirati.¹¹ Alcune applicazioni, tuttavia, sono state limitate dalla mancanza di controllo sul numero di cellule incapsulate nelle gocce. In questo lavoro presentiamo un metodo di incapsulamento ordinato¹² che aumenta l'efficienza di incapsulamento dimostrata per una e due cellule e che potrebbe essere esteso all'incapsulamento di un numero maggiore di cellule.

Per ottenere la generazione di gocce monodisperse, la tecnica microfluidica "a focalizzazione del flusso" consente di creare gocce di dimensioni controllabili di un fluido (una miscela acquosa di cellule) all'interno di un altro fluido (una fase oleosa continua) mediante un ugello in cui i flussi convergono.¹³ Per una geometria dell'ugello fissata, la frequenza di generazione delle gocce f e la dimensione delle gocce possono essere modificate regolando le portate oleosa e acquosa Q_oil e Q_aq. Aumentando le portate, il regime di flusso può passare dalla generazione di gocce al getto instabile del fluido acquoso dall'ugello.¹⁴

Quando la soluzione acquosa contiene particelle in sospensione, le particelle vengono incapsulate e isolate le une dalle altre al livello della punta. Per la generazione di gocce a partire da una sospensione cellulare acquosa distribuita in modo casuale, la frazione media di gocce D_k contenenti k cellule è determinata dalla statistica di Poisson, dove D_k = λ^k exp(-λ)/(k!) e λ rappresenta il numero medio di cellule per goccia. La frazione di cellule che finiscono in gocce correttamente incapsulate viene calcolata utilizzando P_k = (k x D_k)/Σ(k' x D_k'). La sottile differenza tra queste due metriche consiste nel fatto che D_k si riferisce al rendimento del fluido acquoso e alla quantità di selezione delle gocce necessaria dopo l'incapsulamento, mentre P_k si riferisce al rendimento del campione cellulare. Ad esempio, si potrebbe utilizzare una sospensione cellulare diluita (basso λ) per incapsulare gocce in cui la maggior parte delle gocce contenenti cellule ne conterrebbe una sola. Sebbene la metrica di efficienza P_k sarebbe elevata, la maggioranza delle gocce sarebbe vuota (basso D_k), richiedendo pertanto un meccanismo di selezione per rimuovere le gocce vuote, riducendo così anche la produttività.¹⁵

La combinazione della generazione di goccioline con l'ordinamento inerziale consente di incapsulare goccioline con un numero di cellule per gocciolina più prevedibile e portate più elevate rispetto all'incapsulamento casuale. Il focalizzazione inerziale è stata scoperta per la prima volta da Segre e Silberberg¹⁶ e si riferisce alla tendenza di particelle di dimensioni finite a migrare verso posizioni laterali di equilibrio in un flusso canalizzato. L'ordinamento inerziale indica la tendenza delle particelle e delle cellule a organizzarsi passivamente in file equidistanziate, alternate e a velocità costante. Sia il focalizzazione che l'ordinamento richiedono portate sufficientemente elevate (numero di Reynolds elevato) e dimensioni delle particelle (numero di Reynolds della particella elevato)^17,18. In questo caso, il numero di Reynolds Re =uD_h/ν e il numero di Reynolds della particella Rep =Re(a/D_h)², dove u è una velocità caratteristica del flusso, D_h [=2wh/(w+h)] è il diametro idraulico, ν è la viscosità cinematica, a è il diametro della particella, w è la larghezza del canale e h è l'altezza del canale. Empiricamente, la lunghezza necessaria per ottenere file completamente ordinate diminuisce all'aumentare di Re e Re_p. Si noti che i requisiti di Re e Re_p elevati (nell'ordine di 5 e 0,5 rispettivamente per questo studio) possono entrare in conflitto con la necessità di mantenere basse le portate del flusso acquoso per evitare il fenomeno del jetting alla bocchetta di generazione delle goccioline. Inoltre, portate elevate generano maggiori sforzi di taglio sulle cellule, aspetto non trattato nel presente protocollo. Uno studio precedente sull'incapsulamento ordinato ha dimostrato che oltre il 90% delle cellule HL60 incapsulate singolarmente, in condizioni di flusso simili a quelle del presente studio, ha mantenuto l'integrità della membrana cellulare¹². Tuttavia, l'effetto dell'entità e delle scale temporali degli sforzi di taglio dovrà essere attentamente valutato quando si effettuano estensioni a diversi tipi cellulari e parametri di flusso. L'intersezione tra i vincoli relativi all'ordinamento delle cellule, alla generazione delle goccioline e alla vitalità cellulare in termini di portata acquosa definisce un regime operativo ideale per l'incapsulamento controllato di singole e multiple cellule.

Poiché sono molto pochi gli studi che affrontano la distanza inter-train di particelle,^19,20 la determinazione di questa distanza è meglio effettuata empiricamente e dipenderà dalla geometria del canale, dalla portata, dalle dimensioni delle particelle e dalla loro concentrazione. Tuttavia, l'equidistanza laterale tra i train implica che le cellule arrivino a intervalli di tempo prevedibili e costanti. Quando la generazione delle goccioline avviene alla stessa frequenza con cui le cellule ordinate raggiungono l'ugello, le cellule vengono incapsulate all'interno delle goccioline in modo controllato. Questa tecnica è stata utilizzata per incapsulare singole cellule con portate dell'ordine di 15 kHz,¹² un notevole miglioramento rispetto agli studi precedenti che riportavano velocità di incapsulamento dell'ordine di 60-160 Hz.^4,15 Nel lavoro sull'incapsulamento controllato, oltre l'80% delle goccioline conteneva una e una sola cellula, un'efficienza significativamente superiore rispetto alle statistiche di Poisson (casuali), che prevedono un'efficienza media inferiore al 40%.¹²

In lavori precedenti sull'incapsulamento controllato,¹² il numero medio di particelle per goccia λ è stato regolato per ottenere un incapsulamento singolo per cellula. Ipotesizziamo che, regolando le portate, sia possibile incapsulare in modo efficiente un numero qualsiasi di cellule per goccia quando λ è uguale o prossimo al numero desiderato di cellule per goccia. Mentre l'incapsulamento singolo per cellula è utile per determinare le risposte individuali delle cellule a stimoli, l'incapsulamento multiplo fornisce informazioni relative all'interazione tra numeri e tipi controllati di cellule. In questo articolo presentiamo un protocollo, risultati rappresentativi ottenuti utilizzando microsfere di polistirene e una discussione sull'incapsulamento controllato di più cellule mediante un canale passivo per l'allineamento inerziale e una bocchetta per la generazione di gocce.

Protocollo

I protocolli in questa sezione descrivono i materiali e le attrezzature utilizzati specificamente per ottenere i risultati sperimentali presentati. Si noti che i fornitori alternativi per apparecchiature chimiche e possono essere utilizzati.

1. Dispositivo di Fabbricazione e litografia soft

Tecniche standard di litografia soft, ²¹ alcuni dei quali sono stati descritti in articoli precedenti Giove, ²² sono stati utilizzati per la creazione di polidimetilsilossano (PDMS) le reti microcanali legati ai substrati di vetro. Oltre fabbricazione maestro stampo replica di SU-8 fotolitografia, i proc....

Discussione

Nonostante i livelli relativamente alti di ordine, non tutte le gocce conterrà il numero corretto di particelle o cellule. Efficienza di incapsulazione può essere calcolato come numero di cellule o particelle che incapsulate in gocce con l'uso desiderato diviso per il numero totale. Questi dati grezzi può essere ottenuto da un algoritmo automatico video ad alta velocità o da un campione di immagini emulsione raccolto. Questo può essere paragonato alla frazione di particelle P _k incapsulato in una.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
AutoCAD	AutoDesk
Trasparenza Mask	Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist	MicroChem	2050
Dektak Profilometro	Veeco
Petri Dish	BD Falcon	351058
PDMS silicone elastomero Kit	Dow Corning Corp.	Sylgard 184, il Codice materiale (240) 4019862
Vacuum Essiccatore	Jencons	250-030
Vacuum Pump	Alcatel Vacuum Technology	2010 C2
Regolatore di vuoto	Cole-Parmer	EW-00910-10
Forno	Thermo Scientific	Lindberg Blu M, OV800F
Biopsia Punch, 0,75 mm	Harris	Uni-Core 15072
Laboratorio Corona treater	Electro-Technic Products Inc.	BD-20AC, SKU 12051A
Slides di vetro	Gold Seal	3010
AQUAPEL	PPG Industries		Strategia alternativa
Microsfere di polistirene, 9,9 micron	Thermo	G1000
OptiPrep	Sigma-Aldrich	D1556	Non dimostrata
Siringhe Luer-Lok	BD	1 mL: 309628 3 mL: 309.585
FC-40 Fluorocarbon Oil	3M Inc.	Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant	Raindance Technologies
Mineral olio leggero	Prodotti chimici di processo PTI	08042-47-5	Strategia alternativa
Mineral Oil Tensioattivo	Evonik Goldschmidt Corporation	ABIL EM 90	Strategia alternativa
Tygon PVC Tubing	SmallParts	TGY-010
30 Gauge Luer-Lok siringa con ago, 1/2 "	SmallParts	NE-301PL-C
Microscopio invertito	Carl Zeiss Imaging	Axio Observer.Z1
Speed ​​Camera Alta	Vision Research	Phantom V310
Pompe siringa (2)	Chemyx Inc.	Nexus 3000
Olio di silicone	Dow Corning	200 fluido, 10 cSt	Optional per l'archiviazione Emulsion