Combinando goccia generazione monodisperse con ordinamento inerziale di cellule e particelle, si descrive un metodo per incapsulare un numero desiderato di celle o particelle in una singola goccia a tassi kHz. Abbiamo dimostrato efficienze due volte superiori a quelli di incapsulamento non ordinate per raccogliere le gocce singola e doppia-particelle.
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Articolo metodologico
High Throughput singola cellula e cellula Multiple-Micro-incapsulamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
I metodi di incapsulamento microfluidico sono stati precedentemente utilizzati per catturare cellule in gocce acquose monodisperse su scala picolitrica, fornendo un confinamento rispetto a un ambiente fluido in massa, con applicazioni nell'analisi ad alto rendimento, citometria e spettrometria di massa. Descriviamo un metodo che permette non solo di incapsulare singole cellule, ma anche di catturare ripetutamente un numero definito di cellule (in questo caso dimostriamo l'incapsulamento di una e due cellule) per studiare sia l'isolamento che le interazioni tra cellule in gruppi di dimensioni controllate. Combinando tecniche di generazione di gocce con l'ordinamento di cellule e particelle, dimostriamo un incapsulamento controllato di particelle di dimensioni cellulari per un incapsulamento efficiente e continuo. Utilizzando una sospensione acquosa di particelle e un olio fluorocarbonico immiscibile, generiamo gocce acquose in olio mediante un ugello a focalizzazione del flusso. La portata del flusso acquoso è sufficientemente elevata da creare un ordinamento delle particelle che raggiungono l'ugello a frequenze multiple intere della frequenza di generazione delle gocce, incapsulando un numero controllato di cellule in ciascuna goccia. Per risultati rappresentativi, vengono utilizzate particelle di polistirene da 9,9 μm come surrogati cellulari. Questo studio mostra un'efficienza di incapsulamento di singola particella Pk=1 del 83,7% e un'efficienza di incapsulamento di doppia particella Pk=2 del 79,5%, rispetto alle rispettive efficienze di Poisson del 39,3% e del 33,3%. Si dimostra che la costanza della concentrazione di cellule e particelle è di fondamentale importanza per un incapsulamento efficiente, e vengono inoltre trattate le transizioni da gocciolamento a getto.
Introduzione
Le sospensioni cellulari acquose in mezzi continui condividono un ambiente fluido comune che permette alle cellule di interagire in parallelo e omogeneizza gli effetti di cellule specifiche nelle misurazioni effettuate sul mezzo. L'incapsulamento ad alto rendimento delle cellule in gocce su scala picolitro isola i campioni proteggendoli dalla contaminazione incrociata, consente di valutare la diversità cellulare all'interno dei campioni, evita la diluizione di reagenti e biomarcatori espressi e amplifica i segnali provenienti dai prodotti dei bioreattori. Le gocce offrono inoltre la possibilità di riunire gocce in campioni acquosi più grandi o con altre gocce per studi sulle comunicazioni intercellulari.1,2 La riduzione della diluizione implica segnali di rilevamento più intensi, consentendo misurazioni più accurate, nonché la possibilità di ridurre volumi di campione e reagenti potenzialmente costosi.3 L'incapsulamento di cellule in gocce è stato utilizzato per migliorare il rilevamento dell'espressione proteica,4 degli anticorpi,5,6 degli enzimi,7 e dell'attività metabolica8 nell'ambito dello screening ad alto rendimento, e potrebbe essere impiegato per migliorare la citometria ad alto rendimento.9 Altri studi illustrano applicazioni nell'elettrospray bioanalitico di gocce contenenti cellule per spettrometria di massa10 e rivestimenti cellulari superficiali mirati.11 Alcune applicazioni, tuttavia, sono state limitate dalla mancanza di controllo sul numero di cellule incapsulate nelle gocce. In questo lavoro presentiamo un metodo di incapsulamento ordinato12 che aumenta l'efficienza di incapsulamento dimostrata per una e due cellule e che potrebbe essere esteso all'incapsulamento di un numero maggiore di cellule.
Per ottenere la generazione di gocce monodisperse, la tecnica microfluidica "a focalizzazione del flusso" consente di creare gocce di dimensioni controllabili di un fluido (una miscela acquosa di cellule) all'interno di un altro fluido (una fase oleosa continua) mediante un ugello in cui i flussi convergono.13 Per una geometria dell'ugello fissata, la frequenza di generazione delle gocce f e la dimensione delle gocce possono essere modificate regolando le portate oleosa e acquosa Qoil e Qaq. Aumentando le portate, il regime di flusso può passare dalla generazione di gocce al getto instabile del fluido acquoso dall'ugello.14
Quando la soluzione acquosa contiene particelle in sospensione, le particelle vengono incapsulate e isolate le une dalle altre al livello della punta. Per la generazione di gocce a partire da una sospensione cellulare acquosa distribuita in modo casuale, la frazione media di gocce Dk contenenti k cellule è determinata dalla statistica di Poisson, dove Dk = λk exp(-λ)/(k!) e λ rappresenta il numero medio di cellule per goccia. La frazione di cellule che finiscono in gocce correttamente incapsulate viene calcolata utilizzando Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). La sottile differenza tra queste due metriche consiste nel fatto che Dk si riferisce al rendimento del fluido acquoso e alla quantità di selezione delle gocce necessaria dopo l'incapsulamento, mentre Pk si riferisce al rendimento del campione cellulare. Ad esempio, si potrebbe utilizzare una sospensione cellulare diluita (basso λ) per incapsulare gocce in cui la maggior parte delle gocce contenenti cellule ne conterrebbe una sola. Sebbene la metrica di efficienza Pk sarebbe elevata, la maggioranza delle gocce sarebbe vuota (basso Dk), richiedendo pertanto un meccanismo di selezione per rimuovere le gocce vuote, riducendo così anche la produttività.15
La combinazione della generazione di goccioline con l'ordinamento inerziale consente di incapsulare goccioline con un numero di cellule per gocciolina più prevedibile e portate più elevate rispetto all'incapsulamento casuale. Il focalizzazione inerziale è stata scoperta per la prima volta da Segre e Silberberg16 e si riferisce alla tendenza di particelle di dimensioni finite a migrare verso posizioni laterali di equilibrio in un flusso canalizzato. L'ordinamento inerziale indica la tendenza delle particelle e delle cellule a organizzarsi passivamente in file equidistanziate, alternate e a velocità costante. Sia il focalizzazione che l'ordinamento richiedono portate sufficientemente elevate (numero di Reynolds elevato) e dimensioni delle particelle (numero di Reynolds della particella elevato)17,18. In questo caso, il numero di Reynolds Re =uDh/ν e il numero di Reynolds della particella Rep =Re(a/Dh)2, dove u è una velocità caratteristica del flusso, Dh [=2wh/(w+h)] è il diametro idraulico, ν è la viscosità cinematica, a è il diametro della particella, w è la larghezza del canale e h è l'altezza del canale. Empiricamente, la lunghezza necessaria per ottenere file completamente ordinate diminuisce all'aumentare di Re e Rep. Si noti che i requisiti di Re e Rep elevati (nell'ordine di 5 e 0,5 rispettivamente per questo studio) possono entrare in conflitto con la necessità di mantenere basse le portate del flusso acquoso per evitare il fenomeno del jetting alla bocchetta di generazione delle goccioline. Inoltre, portate elevate generano maggiori sforzi di taglio sulle cellule, aspetto non trattato nel presente protocollo. Uno studio precedente sull'incapsulamento ordinato ha dimostrato che oltre il 90% delle cellule HL60 incapsulate singolarmente, in condizioni di flusso simili a quelle del presente studio, ha mantenuto l'integrità della membrana cellulare12. Tuttavia, l'effetto dell'entità e delle scale temporali degli sforzi di taglio dovrà essere attentamente valutato quando si effettuano estensioni a diversi tipi cellulari e parametri di flusso. L'intersezione tra i vincoli relativi all'ordinamento delle cellule, alla generazione delle goccioline e alla vitalità cellulare in termini di portata acquosa definisce un regime operativo ideale per l'incapsulamento controllato di singole e multiple cellule.
Poiché sono molto pochi gli studi che affrontano la distanza inter-train di particelle,19,20 la determinazione di questa distanza è meglio effettuata empiricamente e dipenderà dalla geometria del canale, dalla portata, dalle dimensioni delle particelle e dalla loro concentrazione. Tuttavia, l'equidistanza laterale tra i train implica che le cellule arrivino a intervalli di tempo prevedibili e costanti. Quando la generazione delle goccioline avviene alla stessa frequenza con cui le cellule ordinate raggiungono l'ugello, le cellule vengono incapsulate all'interno delle goccioline in modo controllato. Questa tecnica è stata utilizzata per incapsulare singole cellule con portate dell'ordine di 15 kHz,12 un notevole miglioramento rispetto agli studi precedenti che riportavano velocità di incapsulamento dell'ordine di 60-160 Hz.4,15 Nel lavoro sull'incapsulamento controllato, oltre l'80% delle goccioline conteneva una e una sola cellula, un'efficienza significativamente superiore rispetto alle statistiche di Poisson (casuali), che prevedono un'efficienza media inferiore al 40%.12
In lavori precedenti sull'incapsulamento controllato,12 il numero medio di particelle per goccia λ è stato regolato per ottenere un incapsulamento singolo per cellula. Ipotesizziamo che, regolando le portate, sia possibile incapsulare in modo efficiente un numero qualsiasi di cellule per goccia quando λ è uguale o prossimo al numero desiderato di cellule per goccia. Mentre l'incapsulamento singolo per cellula è utile per determinare le risposte individuali delle cellule a stimoli, l'incapsulamento multiplo fornisce informazioni relative all'interazione tra numeri e tipi controllati di cellule. In questo articolo presentiamo un protocollo, risultati rappresentativi ottenuti utilizzando microsfere di polistirene e una discussione sull'incapsulamento controllato di più cellule mediante un canale passivo per l'allineamento inerziale e una bocchetta per la generazione di gocce.
Protocollo
I protocolli in questa sezione descrivono i materiali e le attrezzature utilizzati specificamente per ottenere i risultati sperimentali presentati. Si noti che i fornitori alternativi per apparecchiature chimiche e possono essere utilizzati.
1. Dispositivo di Fabbricazione e litografia soft
Tecniche standard di litografia soft, 21 alcuni dei quali sono stati descritti in articoli precedenti Giove, 22 sono stati utilizzati per la creazione di polidimetilsilossano (PDMS) le reti microcanali legati ai substrati di vetro. Oltre fabbricazione maestro stampo replica di SU-8 fotolitografia, i processi possono essere effettuati all'esterno di una stanza pulita o cappa pulita, tuttavia, polvere e particelle dovrebbe ancora essere minimizzato per ottenere risultati coerenti.
- Progettare un micro-canale schema come mostrato in figura 1 in AutoCAD (AutoDesk Inc.). Impiegare un produttore di terze parti (Fineline Imaging Inc.) per stampare una risoluzione elevata (50.000 dpi) transmaschera di trasparenza su pellicola Mylar o quarzo dove i canali sono trasparenti su uno sfondo scuro.
- Creare un silicio e SU-8 master photoresist per lo stampaggio replica. In breve, girare SU-8 2050 (MicroChem) photoresist negativo con rpm consigliata dal costruttore su una spin-spalmatrice per creare uno strato spesso 52 micron su una superficie pulita 7,5 cm o 10 wafer di silicio cm. Dopo morbido cuocere, bordo la rimozione del tallone, l'esposizione ai raggi UV attraverso una maschera di contatto, post-esposizione cuocere, lo sviluppo e l'esposizione inondazioni, misurare lo spessore effettivo del SU-8 layer utilizzando un profilometro Dektak (Veeco). Nastro lo stampo principale sul fondo di un 4 "o 5" capsula Petri per preparare stampaggio PDMS replica.
- Mix PDMS base di elastomero con elastomero agente di indurimento (Dow Corning) in un rapporto di 10:1 w / w di base e catalizzatore. Versare ben miscelato precursore PDMS sul maestro silicio per creare uno strato di 2-3 mm di spessore finale. Una miscela di 20 g di base di elastomero con 2 g di agente di indurimento è sufficiente a coprire una 4 "superficie di diametro.
- Posizionare il master stampo PDMS e in essiccatore sotto vuoto (Jencons) di de-il gas non indurito PDMS. Utilizzando un regolatore di pressione (Cole Parmer), lentamente diminuire la pressione estensimetro camera da 0 "Hg a -27" Hg oltre 20 minuti per evitare eccessiva formazione di schiuma. Lasciare dispositivo in camera da vuoto a -27 "Hg per 30 minuti o fino a bolle d'aria scomparire.
- Rilascio del vuoto e spostare stampo master e PDMS ad un forno a 65 ° C (Thermo Scientific) per un minimo di quattro ore. Il dispositivo può essere lasciato nel forno durante la notte per migliorare la vulcanizzazione.
- Rimuovere il dispositivo dal forno e lasciare raffreddare. Tagliare con cautela PDMS intorno wafer circolare usando un coltello di precisione e la buccia fuori PDMS. Tagliare contorno dispositivo come mostrato in figura 1 con un bisturi.
- Punch porte fluidico (tre per dispositivo) nelle tre regioni rotonde mostrati in figura 1 con un punzone biopsia. Per questo dispositivo, utilizzare uno 0,75 millimetri di diametro esterno punzone (Harris).
- Aderire nastro adesivo sul lato modellato del PDMS e la buccia di cancellare qualunquepolvere. Come alternativa di risparmio di costi, ma praticabile per apparati convenzionali plasma di ossigeno, 21,22 plasma trattare il lato modellato del PDMS e un ambiente pulito 3 "x 1" vetrino per microscopio usando un portatile di laboratorio corona treater (Electro-Technic Products Inc .) 23. Si noti che questo dispositivo dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante o zona ben ventilata causa dello scarico di ozono, e di tutti gli orologi e telefoni cellulari devono essere tenuti almeno dieci metri di distanza. Regolare la corona di raggiungere una corona stabile, con un minimo scintille. Lentamente sventolare l'elettrodo circa 1/4 "sopra ogni superficie per circa 20 secondi e poi subito a portare le superfici trattate in contatto in modo da formare un forte legame permanente prima che le superfici PDMS ritornano al loro stato nativo.
- Posizionare il dispositivo su una piastra metallica, posto in un forno freddo, impostare il forno a 120 ° C, e cuocere notte per completare legame e per riportare il PDMS al suo stato originale idrofobo. 24 Durante questa cottura ad alta temperatura, tegli superficie di vetro del canale anche essere reso idrofobo dovuta alla deposizione di uno strato idrofobo sottile sul vetro. In alternativa, rivestimenti idrofobi come AQUAPEL (PPG Industries) può essere iniettato nei porti fluidici utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da siringa. 12 cura ma fermamente iniettare il AQUAPEL seguita da spurgo dell'aria nei porti fluidici senza rompere il vetro di PDMS legame . Aggressivamente ripetere lo spurgo d'aria su tutte le porte di entrata e uscita, mentre pulendo l 'eventuale AQUAPEL eccesso al fine di evitare eventuali depositi che potrebbero ostruire i canali dopo l'essiccazione.
2. Preparazione del campione
- Preparare una coltura cellulare secondo le procedure stabilite per il vostro tipo di cellula scelto. Per il particolare dispositivo utilizzato in questo studio, 8-15 micron di particelle o cellule devono ordinare in modo adeguato per l'incapsulamento. Tipi di cellule più piccole o più grandi possono richiedere variando le dimensioni del canale di messa a fuoco per ottenere un'adeguata Re p. Per il merisultati dimostrazione THOD mostrato in questo articolo, 9,9 micron microsfere di polistirene (G1000, Thermo Scientific) sono utilizzati come surrogati delle cellule.
- Preparare la particella o sospensione acquosa delle cellule attraverso la miscelazione delicata. Quando si usano cellule o particelle di polistirene, di controllo della concentrazione è essenziale (vedi Figura 4) per ottenere ideale incapsulamento ordinato. Utilizzando i dati precedenti 12 come guida, calcolare la cella desiderata o concentrazione di particelle in base alla spaziatura treno ordinato e micro-canale formato come: una cella o particella per orari dei treni previsti longitudinali spaziatura tra la focalizzazione canale sezione trasversale. Se la concentrazione magazzino (1% w / w) è insufficiente, aumentare la concentrazione (qui al 1,5% w / w) delicatamente centrifugazione del campione archivio, rimuovere il liquido supernatante, e ri-sospensione le particelle di vortex, o miscelazione gentile quando si utilizzano celle. Preparare la quantità necessaria per tenere conto del volume di raccolta desiderato e per la fase di esecuzione associata a flOW tuning.
- Entrambe le cellule e particelle di polistirene avere un peso specifico maggiore di uno. Sebbene non mostrato in questo protocollo, per esperimenti a lungo termine di durata dell'ordine di parecchi minuti ad alcune ore, galleggiabilità corrispondere la soluzione aggiungendo un soluto come CaCl 2 per particelle o OptiPrep (Sigma-Aldrich) per le cellule.
- Preparare un campione di 10 ml della fase continua olio fluorocarbonio miscelando l'olio fluorocarburico FC-40 (3M) e PFPE-PEG blocco tensioattivo copolimero a 25 (2,5% w / w) (Raindance Technologies) in una provetta da centrifuga da 15 mL. In alternativa, l'olio minerale leggero (Chemicals processo PTI) può essere utilizzato con ABIL-EM 90 tensioattivo (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).
3. Setup sperimentale
- Accendere il microscopio ottico invertito (Axio Observer, Zeiss) e la macchina fotografica ad alta velocità (Phantom V310, Vision Research). Focus e ispezionare i canali per zoccoli e detriti dal manualmente spostando il dispositivo outilizzando una fase microscopio motorizzato. Alcuni piccoli detriti possono essere spinto fuori quando i flussi di liquido attraverso. Per i detriti più grandi o evidenti zoccoli, selezionare un altro canale sul dispositivo, come i detriti nel canale di messa a fuoco può degradare in modo significativo la qualità di ordinazione. Si noti che gli zoccoli possono essere rimossi in condizioni di flusso premendo con forza sulla superficie PDMS al di sopra della regione colpita con una pinzetta contundenti.
- Tagliare tre lunghezze di tubo in PVC (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) per l'ingresso acquosa, di ingresso e di uscita olio, emulsione. Per ridurre al minimo volume morto, quel tanto che basta tagliare tubi per raggiungere dalle pompe siringa alla fase microscopio. Tagliare estremità tubi un angolo di 45 ° per facilitare l'inserimento nei porti fluidici.
- Utilizzare delle pinzette per premere fissare il tubo finisce nei porti fluidici perforate nel passaggio 1 e quindi premere il montaggio di due calibro 30 a punta smussata aghi da siringa in acciaio inox (SmallParts) nelle estremità libere del acquosa rispettivi tubi di ingresso e di olio (non necessario adesivo) . Posizionare il tubo di uscita in un r rifiutieservoir. Questo tubo viene successivamente spostato in un serbatoio di raccolta.
- Spostare il dispositivo e il tubo collegato alla fase microscopio, allineare, e concentrarsi su l'ugello dispositivo utilizzando un obiettivo disponibile (20x è stato utilizzato per questo esperimento). Regolare per K hler illuminazione e altre impostazioni del microscopio come richiesto per la registrazione ottimale.
- Riempire una siringa da 1 ml (BD) con ben miscelato fase acquosa e una siringa da 3 mL (BD) con la fase oleosa soluzione preparata nella fase 2. Si noti che tutte le siringhe di ogni volume può essere usato e deve essere attentamente selezionati a seconda dei tempi di esecuzione desiderati e la minimizzazione di qualsiasi pulsatilità. Inclinare una siringa in verticale e sfiorare per passare le bolle d'aria alla presa di siringa. Premere lentamente lo stantuffo sufficiente per spingere l'aria per la punta della siringa. Tenendo la siringa verticalmente, collegare le siringhe per l'ago della siringa rispettivo già attaccato al dispositivo nella Fase 3,3. Premere lo stantuffo per forzare l'aria attraverso il volume ago della siringa morto finché il liquido è psvuotata attraverso il tubo quasi al dispositivo. Montare saldamente la siringa per una pompa a siringa (Nexus 3000, Chemyx) e coinvolgere il blocco dello stantuffo. Ripetere i collegamenti per la seconda siringa e montare una pompa seconda siringa.
- Accendere ogni pompa siringa e programma utilizzando i protocolli del produttore pompa. Impostare le portate iniziali di Q olio = 50 microlitri / min e Q = aq 5 microlitri / min per la fase olio e fase acquosa, rispettivamente. Avviare le pompe.
- Attendere per ciascun fluido di entrare nel dispositivo e riempire i canali, spingendo fuori l'aria restante morto. Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti. Se c'è una grande quantità di aria nel tubo di ingresso, aumentare temporaneamente ciascuna portata finché l'aria viene espulsa. Non aumentare le portate così alte che le pressioni di grandi dimensioni si verificano nel canale, che porta a PDMS-to-vetro fallimento bond.
- Utilizzando le portate iniziali, osservare la formazione di gocce al ugello (risultati qui: 20x magnification, il frame rate 21005 fps, l'esposizione 3 ms). Ridurre il campo di vista telecamera solo l'ugello per massimizzare il frame rate e ridurre i requisiti di memoria, se possibile. Acquisizione di video di esempio e verificare che la frequenza di campionamento è sufficiente per evitare l'aliasing.
- Per evitare di getto (vedi figura 2), iniziare con bassi tassi di flusso acquose. Lentamente aumentare il tasso di flusso acquoso di osservare ordinamento delle particelle nel canale lungo soluzione acquosa come all'aumentare della portata.
- Se la concentrazione di particella è troppo bassa per fornire treni con relativamente poche "dispersi" e particelle del campione non è stato galleggiabilità trovati, fisicamente inclinare la pompa a siringa verso l'uscita siringa per fornire graduale sedimentazione delle particelle verso l'uscita siringa. Questo metodo è illustrato nel protocollo video. Periodicamente ruotando la siringa lungo il suo asse può anche ridurre sedimentazione indesiderato.
- Una volta ordinamento adeguata verifica, regolare la portata di olio per sintonizzare la frequenza di generazione edimensione delle gocce. Il volume di goccia media può essere calcolata utilizzando la velocità di flusso acquoso divisa per la frequenza di generazione goccia misurata mediante cattura video. Iterativamente regolare entrambi i flussi di raggiungere tassi di incapsulamento desiderati e volumi goccia.
- Una volta ordinato stabile incapsulamento è confermata, spostare il tubo di uscita dal serbatoio dei rifiuti in un serbatoio di raccolta o di un mangime in un altro dispositivo per il test successivo.
- Determinare il tempo di raccolta in base al numero desiderato di goccioline e la frequenza di generazione calcolato.
- Registrare la frazione di gocce contenenti 0, 1, 2, ..., N particelle di quantificare l'efficienza utilizzando sia risultati goccia video di generazione o pipettando un campione di emulsione raccolto per l'ispezione.
4. Risultati rappresentativi
I risultati sono presentati che conseguire sia controllato singola particella e particella controllato in doppio-incapsulamento (Figura 3). Con il tagliola portata FC-40 di olio a metà, una singola particella, incapsulamento diventa due particelle incapsulamento. Al contrario, avremmo potuto aumentato il tasso di flusso acquoso di consegnare le particelle all'ugello più rapidamente, ma avrebbe anche aumentato il rischio di getto del flusso acquoso. Gli istogrammi in figura 3 presenta il numero frazionario di particelle per caduta per i due casi, insieme con confronti con le statistiche Poisson. Le gocce occasionali con le particelle a zero sono principalmente dovute al "mancante" particelle nei treni ordinati, mentre i casi in cui ci sono particelle più incapsulati che risultato desiderato da locali elevate concentrazioni di particelle e le particelle che a volte migrano verso una delle due posizioni verticali messa a fuoco. Si noti che galleggiamento corrispondente come descritto al punto 2 non è stato utilizzato. Invece, la pompa a siringa è stata fisicamente inclinato per permettere deposizione di particelle verso l'uscita siringa, portando a una concentrazione elevata di particelle durante la corsa.
Un percorso sperimentale che illustra la necessità di particella e corretta concentrazione cellulare è mostrato in Figura 4. Senza ordine completo, i gruppi localizzati di ordine particelle e sono incapsulati, ma tante gocce sono senza particelle. Un istogramma mostra l'efficienza di incapsulazione diminuito per il desiderato due incapsulamento delle particelle.
Figura 1. Dispositivo di incapsulamento. a) totale con dispositivo di insenature, outlet, e lungo canale di ordinazione. L'altezza del dispositivo è di 52 micron e la larghezza del canale di ordinazione è di 27 micron. b) Sia acquoso e bocche olio hanno filtri detriti grandi fessure l'ordine della larghezza del canale di ordinazione per la vista ingrandita di ingresso dell'olio. c) La vista ingrandita dell'ugello mostra uguali larghezze di canale di 27 micron per i canali acquosi e olio, seguiti dalla contrazione ugello di 22 micron e improvvisa espansione a un canale più ampio 61 um.Si noti che le dimensioni del dispositivo illustrato qui sono stati verificati utilizzando un profilometro dopo microfabbricazione e differiscono leggermente dalle dimensioni nominali sulla maschera. Una vera immagine del canale di ordinazione e l'ugello sono disponibili on-line come figura supplementare 1 . La maschera di file di AutoCAD è stata inoltre inserita on-line come un supplemento a questo manoscritto.
Figura 2. Isteresi di un gocciolamento di transizione getto utilizzando un dispositivo più ampio (80 micron di larghezza x 22 um alto). a) A rate costante flusso FC-40 (Q olio = 45 microlitri / min), si verifica la formazione calo costante a 10 kHz con una soluzione acquosa di portata Q aq = 8 microlitri / min. Poiché il flusso acquosa viene lentamente aumentata a 10 m &u; L / min, getto del flusso di fluido acquoso viene attivato. b) Quando la portata viene restituito a 8 microlitri / min getto continua. Si noti che la formazione calo costante può essere ristabilita con una breve pausa la pompa di flusso acquoso (una pausa di 1 secondo è tipico).
Figura 3. Incapsulamento singolo e doppio-particella. A) formazione delle gocce con una cella per goccia (Q olio = 60 microlitri / min, Q aq = 9 pl / min) con un tasso di abbandono generazione di 6,1 kHz, dimensioni calo medio del 24,4 pL, e una singola cellula l'efficienza di cattura D k = 79,5% e P k = 83,7% (λ = 0,95) per un campione di n d = 517 gocce e n p = 491 particelle. b) la formazione di discesa a due celle per goccia si ottiene semplicemente riducendo l'FC-40 velocità di flusso di olio Q a 30 μL / min. Più grande (39,8 pL) gocce sono formate a un tasso di 3,8 kHz con due celle efficienza di cattura D k = 71,5% e P k = 79,5% (λ = 1,80) per un campione di dimensione n d = 383 gocce e n p = 689 particelle. cd) Due istogrammi confrontare l'efficienza di incapsulamento delle particelle goccia D k ha ordinato di incapsulamento singolo e doppio di particelle con le statistiche di Poisson (incapsulamento casuale). Si noti che per entrambi i casi, la spaziatura delle particelle nella direzione del flusso è circa 17-18 micron per completamente ordinati particelle alternati. Video supplementari mostrano sia l'incapsulamento singolo e doppio-particelle sono disponibili online. Clicca qui per vedere 3 film supplementari . Clicca qui per vedere 3b Movie supplementari .
Concentrazione Figura 4. Influisce notevolmente l'efficienza di incapsulamento. A) al diminuire della concentrazione, l'ordinamento piena non si verifica, e quindi "buchi" nei treni emergono, lasciando qualche goccia con meno di particelle previsti. B) L'istogramma mostra la minore efficienza ( D k = 55,9%, P k = 70,9%) per due particelle incapsulamento a causa di un valore inferiore di λ = 1,57 dove ci sono tanti quanti singola particella, diminuisce in quanto vi sono due particelle gocce. Ciò risulta dalla figura Q olio = 30 microlitri / min e Q aq = 9 pL / min, le condizioni di flusso stesse di figura 3b. Un video rappresentante supplementare è disponibile online. Clicca qui per vedere Supplemental Movie 4 .
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Discussione
Nonostante i livelli relativamente alti di ordine, non tutte le gocce conterrà il numero corretto di particelle o cellule. Efficienza di incapsulazione può essere calcolato come numero di cellule o particelle che incapsulate in gocce con l'uso desiderato diviso per il numero totale. Questi dati grezzi può essere ottenuto da un algoritmo automatico video ad alta velocità o da un campione di immagini emulsione raccolto. Questo può essere paragonato alla frazione di particelle P k incapsulato in una...
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Dichiarazioni
JE è un inventore di un brevetto basato sulla tecnologia utilizzata in questo manoscritto.
Ringraziamenti
Ringraziamo Technologies Raindance per il campione di PFPE-PEG tensioattivo utilizzato in questo studio, e ringraziamo il BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, regista) per lo stampo wafer di silicio utilizzati per creare repliche di canale PDMS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| AutoCAD | AutoDesk | ||
| Trasparenza Mask | Fineline Imaging Inc. | ||
| SU-8 Photoresist | MicroChem | 2050 | |
| Dektak Profilometro | Veeco | ||
| Petri Dish | BD Falcon | 351058 | |
| PDMS silicone elastomero Kit | Dow Corning Corp. | Sylgard 184, il Codice materiale (240) 4019862 | |
| Vacuum Essiccatore | Jencons | 250-030 | |
| Vacuum Pump | Alcatel Vacuum Technology | 2010 C2 | |
| Regolatore di vuoto | Cole-Parmer | EW-00910-10 | |
| Forno | Thermo Scientific | Lindberg Blu M, OV800F | |
| Biopsia Punch, 0,75 mm | Harris | Uni-Core 15072 | |
| Laboratorio Corona treater | Electro-Technic Products Inc. | BD-20AC, SKU 12051A | |
| Slides di vetro | Gold Seal | 3010 | |
| AQUAPEL | PPG Industries | Strategia alternativa | |
| Microsfere di polistirene, 9,9 micron | Thermo | G1000 | |
| OptiPrep | Sigma-Aldrich | D1556 | Non dimostrata |
| Siringhe Luer-Lok | BD | 1 mL: 309628 3 mL: 309.585 | |
| FC-40 Fluorocarbon Oil | 3M Inc. | Sigma Aldrich, F9755 | |
| PFPE-PEG Fluorosurfactant | Raindance Technologies | ||
| Mineral olio leggero | Prodotti chimici di processo PTI | 08042-47-5 | Strategia alternativa |
| Mineral Oil Tensioattivo | Evonik Goldschmidt Corporation | ABIL EM 90 | Strategia alternativa |
| Tygon PVC Tubing | SmallParts | TGY-010 | |
| 30 Gauge Luer-Lok siringa con ago, 1/2 " | SmallParts | NE-301PL-C | |
| Microscopio invertito | Carl Zeiss Imaging | Axio Observer.Z1 | |
| Speed Camera Alta | Vision Research | Phantom V310 | |
| Pompe siringa (2) | Chemyx Inc. | Nexus 3000 | |
| Olio di silicone | Dow Corning | 200 fluido, 10 cSt | Optional per l'archiviazione Emulsion |
Riferimenti
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