Trapianto di intestino tenue è diventata una opzione di trattamento per i pazienti con accettato irreversibile insufficienza intestinale. Il nostro modello sperimentale di trapianto ortotopico di intestino tenue nel ratto è uno strumento affidabile per affrontare immunologiche di base e processi infiammatori che complicano trapianto di intestino.
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Articolo metodologico
Ortotopico di intestino tenue di ratti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trapianto di intestino tenue è diventata un'opzione accettata clinico per i pazienti con sindrome dell'intestino corto e il fallimento della nutrizione parenterale (irreversibile insufficienza intestinale). In centri specializzati migliorato operativa e le strategie di gestione hanno portato a eccellenti a breve e medio termine paziente e la sopravvivenza del trapianto con una qualità della vita elevata 1,3. A differenza del più comune di trapianto di altri organi solidi (cuore cioè, fegato) molti meccanismi alla base della funzionalità del trapianto e alterazioni immunologiche indotte dal trapianto di intestino non sono del tutto noti 6,7. Gli episodi di rigetto acuto, sepsi e insufficienza cronica del trapianto sono i principali ostacoli che contribuiscono ancora meno favorevole esito a lungo termine e ostacolare un impiego più diffuso della procedura, nonostante un numero crescente di pazienti in nutrizione parenterale domiciliare che avrebbe potenzialmente beneficiare di un tale trapianto. Il piccolo intestino contieneun gran numero di leucociti passeggeri comunemente indicato come parte del sistema linfoide associato intestino (GALT), essendo questa parte del motivo della immunogenity alta del graft intestinale. La presenza e la vicinanza di molti commensali e patogeni nell'intestino spiega la gravità degli episodi di sepsi volta innesto integrità della mucosa è compromessa (per esempio rigetto). Per far avanzare il campo di dati intestinali e trapianto multiorgano più generati da modelli animali affidabili e fattibile è necessario. Il modello fornito combina qui sia l'affidabilità e la fattibilità, una volta stabiliti in modo standardizzato e in grado di fornire informazioni preziose nei sottostanti complessi molecolari, meccanismi cellulari e funzionali che sono attivati da trapianto di intestino. Abbiamo utilizzato con successo e raffinato la procedura descritta su più di 5 anni nel nostro laboratorio 8-11. Il JoVE video-formato è particolarmente utile per dimostrare la procedura complessaDure e evitare le insidie iniziali per i gruppi che intendono stabilire un modello ortotopico roditore indagando trapianto di intestino.
Protocollo
1. Donatori di funzionamento
- Il topo donatore deve essere tenuto a digiuno per 24 ore (libero accesso all'acqua / soluzione di glucosio).
- Per indurre l'anestesia isoflurano inalazione, inizia con il 2% di atomizzatore standard, e quindi ridurre a 1% dopo aver eseguito laparotomia. Eseguire un pizzico punta per controllare la sedazione.
- Shave l'addome e pulire con la preparazione della pelle 3 volte (Kodan). Quindi, eseguire una incisione mediana dopo somministrazione sottocutanea di analgesico.
- Dopo l'innesto è avvolto in soluzione salina garza imbevuta, separare le aderenze fisiologiche tra il pancreas e il colon ascendente delicatamente con un Q-tip (sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento 6x).
- Legare e sezionare i vasi coliche ileocecale e destra e centro con 7-0 seta. Dopo che il colon ascendente si sviluppa sul lato destro della vena mesenterica superiore (SMV), i vasi coliche ileocecale, destro e centrale può essere identificato per la legatura e la divisione con legami 7-0.
- Disimpegno stomaco verso l'alto, in modo che l'intera SMV è raddrizzato ed esposta. Utilizzare un morsetto zanzara per lo svincolo. La pinza è detenuto da massa plastilina formata in forma, se necessario.
- Legare e dividere i pancreatico-duodenali vene provenienti dalla SMV. Tutti piccole pancreatico-duodenale vene provenienti dal SMV deve essere accuratamente identificata, ligato con 7-0 seta e divisa prima che il tessuto pancreatico può essere rimosso dal trapianto.
- Legare e sezionare il tessuto connettivo perde compresi tutti linfatici tra la SMV e l'aorta addominale. Con l'innesto ancora sul lato destro dell'addome, il tessuto connettivo perde compresi tutti linfatici tra la SMV e l'aorta addominale è accessibile. Questo tessuto connettivo deve essere ligati utilizzando 7-0 seta e diviso per evitare lymphorrhea postoperatoria dal graft intestinale.
- Legare e sezionare l'arteria renale destra. Dopo che il tessuto connettivo è diviso, l'arteria renale destra diventa accessible ed è legata e sezionata utilizzando seta 7-0.
- Sistemica heparinise il topo con 200 unità di eparina iv attraverso la vena del pene.
- Legare le arterie marginali, e dividere il piccolo intestino al duodeno-digiunale giunzione e l'ileo terminale.
- L'aorta è ligato prossimalmente all'origine della SMA. La vena porta è attraversata alla confluenza con la vena splenica. Poi l'innesto viene raccolto con il suo peduncolo vascolare che consiste della SMA con un segmento aortico.
2. Procedura Backtable
- Perfondere l'innesto con 3 ml di soluzione University of Wisconsin (UW) a 4 ° C tramite il condotto aortica e irrigare il lume intestinale dall'estremità digiunale con 30 ml di soluzione Nebacetin Uro-N a 4 ° C (irrigazione lumen è obbligatorio) .
Immediatamente dopo l'estrazione della protesi, il condotto aortica è utilizzato per perfusione con 3 ml di soluzione refrigerata UW. Per questo, un catetere 20 G iv sullauna siringa da 10 ml viene utilizzato. Il perfusato deve essere osservato defluire liberamente dalla vena porta divisa. Per l'irrigazione intestinale con Nebacetin, una siringa da 50 ml viene utilizzato.
- Memorizzare l'innesto in soluzione UW a 4 ° C durante la preparazione del destinatario.
3. Destinatario di funzionamento
- Il ratto del destinatario deve essere tenuto a digiuno per 24 ore (libero accesso all'acqua / soluzione di glucosio).
- Per indurre l'anestesia isoflurano inalazione, inizia con il 2% di atomizzatore standard, e quindi ridurre a 1% dopo aver eseguito laparotomia. Eseguire un pizzico punta per controllare la sedazione.
- Shave l'addome e pulire con la preparazione della pelle 3 volte (Kodan). Quindi, eseguire una incisione mediana dopo la somministrazione sottocutanea di Carprofen 5 mg / kg sc per analgesia intraoperatoria.
- Avvolgere l'intestino destinatario in soluzione salina normale garza imbevuta e posizionarlo sul petto del destinatario.
- Aprire il retroperitoneo senza mezzi termini con Q-tips, ed esporre la addominalinal aorta e vena cava inferiore appena sotto i vasi renali fino al livello dei vasi iliaci, se necessario anche utilizzare microforbici. Legare le tribuaries piccole e spinali lombari dal aorta e vena cava con 7-0 di seta per evitare la perdita di sangue. (Per fare questo, modificare lo zoom a 16x microscopio chirurgico.)
- Cross-clamp l'aorta e l'IVC sotto i vasi renale sinistra prossimalmente e sopra la biforcazione iliaca distalmente con clips microcircolo. Un solo morsetto viene utilizzato prossimale e distale per serrare contemporaneamente entrambe le navi. Incidere entrambe le navi anteriormente con un microknife e lavare il sangue residuo.
- Creare un end-to-side anastomosi tra il segmento aortico sottorenale innesto e del destinatario utilizzando un continuo 10-0 sutura Prolene .. Inizialmente, l'innesto è posto sul lato destro dell'addome (la testa del ratto posizionato a ore 12) per eseguire le maglie parete posteriore della anastomosi arteriosa e legatura della sutura soggiorno inferiore. Then, l'innesto è rivolto verso il lato sinistro dell'addome (la testa del ratto posizionato a ore 9) per esporre e suturare la parete anteriore della anastomosi.
- Un end-to-side anastomosi tra la vena porta innesto e IVC del destinatario viene eseguita similmente eseguendo usando suture 10-0 Prolene. Con il topo ancora sdraiato lateralmente (testa in posizione ore 9), l'innesto è posizionato sul lato sinistro dell'addome e una sutura soggiorno inferiore è posto. L'anastomosi viene avviata con la parete posteriore dall'interno del recipiente. Dopo la sutura soggiorno inferiore è legato, i punti della parete anteriore può essere eseguita dall'esterno.
- Rimuovere i morsetti distali primi, seguiti da i morsetti superiori. Qualsiasi sanguinamento anastomotica è controllata dalla pressione diretta con Q-tips. L'innesto deve essere controllata per riperfusione uguali e veloce.
- Resecare tenue del destinatario intero dopo la legatura dei vasi mesenterici. Destinatari sottoposti enterectomia subtotale, conservando 2-3 cm di proximal digiuno e 1 cm di ileo distale.
- Ripristinare la continuità enterica da prossimale (jejuno-digiunostomia) e distale (ileo-ileale) end-to-end anastomosi intestinali utilizzando un interrotto uno strato di 6-0 Monocryl sutura. Circa 16 punti di sutura sono necessari per completare le anastomosi.
- Irrigare la cavità peritoneale con soluzione fisiologica fino a completa pulizia. Somministrare 2 ml di soluzione salina normale per via intraperitoneale per la sostituzione del fluido. Quindi chiudere l'addome con una sutura continua con Vicryl 3-0 per lo strato muscolare più una sutura della pelle continua.
- Nel periodo post-operatorio i topi dovrebbero essere tenuti a digiuno (con accesso ad acqua e una soluzione di glucosio) per un altro 24 h quindi riavviato sul ratto chow standard e acqua ad libitum. Analgesia con carprofen deve essere somministrato per 3 giorni (vedi dosi di seguito).
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Risultati
Normale decorso post-operatorio
Gli animali trapiantati dovrebbero recuperare rapidamente dalla procedura di cui una lampada di calore per circa 1 ora. L'ipotermia è una delle principali cause di mortalità postoperatoria e deve essere accuratamente evitata intra-e post-operatorio. Perdite di liquidi intraoperatori deve essere sostituito con un'iniezione sottocutanea di 2,5 ml di soluzione salina normale, più 2,5 ml di glucosio al 5% ogni 8 ore per le prime 24 ore. I ratti dovrebbero ave...
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Discussione
Mentre i modelli di trapianto intestinale nel ratto sono stati descritti già nel 1970ies 5 più dei modelli di recente attività subordinate coinvolgere eterotopico trapianto di intestino con tecniche diverse 13. Mentre le procedure eterotopiche in generale hanno il vantaggio di tecniche microchirurgiche più facile accessibilità dell'innesto di valutazione, eterotopico trapianto di intestino ha il grande svantaggio di non prendere in considerazione le interazioni multiple del piccolo intestino tr...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Università del Wisconsin (UW) soluzione (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Uro-Nebacetin N soluzione | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicillin | Ratiopharm | ||
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Prolene 10-0 sutura unresorbable | Ethicon | ||
| Monocryl 6-0 sutura riassorbibile | Ethicon | ||
| Vicryl 3-0 sutura riassorbibile | Ethicon | ||
| iv catetere G 20 millimetri 1.1x33 | Braun | ||
| iv catetere G 22 0.9x25 millimetro | Braun | ||
| Kodan pelle Prep | Schülke | ||
| NaCl soluzione di infusione 0,9% | Braun | ||
| Pinze curve piccolo | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Micro pinza curva | AESCULAP | BD 333 | |
| Micro pinza curva | AESCULAP | FD281R | |
| Micro pinza dritto 1 | WPI | 5 | |
| Micro pinza diritto 2 | WPI | 2 | |
| Micro supporto dell'ago | WPI | 14081 | |
| Micro forbici | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Micro bisturi | MANI | Oftalmica coltello | |
| Morsetti Micro | AESCULAP | FB329R |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
