Campionamento umana peptidoma Indigenous Saliva Utilizzando un Lollipop-Like Probe ultrafiltrazione: Semplificare e migliorare la rilevazione Peptide per spettrometria di massa Clinica

Sommario

Considerando campionamento saliva per il futuro l'applicazione clinica, un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) la sonda è stato fabbricato per adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi diretta di saliva non digerito da nanoLC LTQ-spettrometria di massa ha dimostrato la capacità di sonde LLUF per rimuovere le proteine ​​di grandi dimensioni e di proteine ​​ad alta abbondanza, e rendere a basso abbondanti peptidi più rilevabile.

Abstract

Anche se saliva proteoma umano e peptidoma sono stati rivelati ^1-2 sono stati identificati da majorly digerisce trittico di proteine ​​salivari. Identificazione di peptidoma indigeno di saliva umana senza preventiva digestione con enzimi esogeni diventa imperativo, in quanto i peptidi nativi nella saliva umana fornire i valori possibili per la diagnosi della malattia, prevedere la progressione della malattia, e monitorare l'efficacia terapeutica. Di un campione adeguato è un passo fondamentale per la valorizzazione di identificazione delle risorse umane peptidoma saliva indigena. I metodi tradizionali di campionamento saliva umana che coinvolge la centrifugazione per rimuovere i detriti ^3-4 potrebbe essere troppo tempo per essere applicabile per uso clinico. Inoltre, la rimozione dei detriti mediante centrifugazione può essere in grado di pulire la maggior parte dei patogeni infetti e rimuovere le proteine ​​molto abbondante, che spesso ostacolano l'individuazione di peptidoma scarsa abbondanza.

Convenzionali approcci proteomici che pripalmente utilizzano bidimensionale elettroforesi su gel (2-DE) gel in coniugazione con in-gel digestione sono in grado di identificare molte proteine ​​saliva ^5-6. Tuttavia, questo approccio non è in genere sufficientemente sensibile per rilevare peptidi / proteine ​​poco abbondanti. Liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) proteomica base è una alternativa che può identificare proteine ​​senza preventiva 2-DE separazione. Sebbene questo approccio fornisce una maggiore sensibilità, deve generalmente campione prima pre-frazionamento ⁷ e pre-digestione con tripsina, che rende difficile per l'uso clinico.

Per aggirare l'ostacolo in spettrometria di massa dovuta alla preparazione del campione, abbiamo sviluppato una tecnica chiamata ultrafiltrazione capillare (CUF) sonde ^8-11. I dati del nostro laboratorio hanno dimostrato che le sonde CUF sono in grado di catturare proteine ​​in vivo da diversi microambienti in animali in modo dinamico e minimamente invasiva ^{8 -}11. N centrifugazione è necessario in quanto una pressione negativa viene creata semplicemente siringa ritiro durante il prelievo. Le sonde CUF combinati con LC-MS sono riusciti a identificare le proteine ​​trittico-digerite ^8-11. In questo studio, abbiamo aggiornato la tecnica di campionamento ultrafiltrazione con la creazione di un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) sonda che può facilmente adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi da LC-MS senza digestione con tripsina ha mostrato che la saliva umana indigenamente contiene molti frammenti peptidici derivati ​​da varie proteine. Campionamento saliva con sonde LLUF evitato centrifugazione, ma rimosso in maniera efficace molte proteine ​​abbondanza più grandi e più alta. I nostri risultati di spettrometria di massa ha evidenziato che molti peptidi poco abbondanti è diventato rilevabile dopo filtrare le proteine ​​più grandi con sonde LLUF. Individuazione di peptidi a basso saliva abbondanza era indipendente multi-fase di separazione campione con cromatografia. Per l'applicazione clinica, le sonde LLUF incorporanod con LC-MS potrebbero essere utilizzati in futuro per monitorare la progressione della malattia da saliva.

Protocollo

1. Creazione di sonde LLUF

1. Le membrane polietersulfone ⁽² cm 2) sono stati sigillati con pale in polipropilene triangolo (University of California, San Diego) da membrane incollaggio con resina epossidica ai confini della palette. Una membrana carica negativamente polietersulfone con un peso molecolare cut-off (MWCO) a 30 kDa è stato utilizzato.
2. Un tubo di Teflon fluorurato etilene-propilene (diametro interno / diametro esterno, 0.35/0.50 cm) è stato attaccato ad un cilindro di uscita di una paletta polipropilene triangolo modo che la sonda LLUF può essere collegato ad una siringa da 20 ml.
3. Dopo l'ammollo la membrana poli....

Discussione

Abbiamo scoperto che esistono molti frammenti peptidici in saliva umana non digerito. Questi frammenti peptidici sono derivati ​​dalle varie forme di prolina ricchi di proteine, actina, alfa amilasi, alfa 1 globina, beta globina, histain 1, cheratina 1, mucina 7, del recettore immunoglobuline polimerico, satherin, S100A9. Ci possono essere molti fattori che contribuiscono alla produzione di peptidi con siti di clivaggio indeterminato. Per esempio, alcuni frammenti peptidici possono essere naturalmente presenti in tutta .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Polietersolfone membrane	Pall Corporation		30 kDa MWCO
Teflon fluorurato etilene propilene tubo	Upchurch Scientific
Blu destrano	Sigma
Nano sistema LC	Eksigent
Trap colonna C18	Agilent	5065-9913
LTQ lineare trappola ionica Spettrometro di massa	Thermo Fisher
Stregone 2	Sage-N Research
Acetonitrile-0.1% di acido formico	JT Baker	9832-03	LC / MS di grado
Acqua 0,1% di acido formico	JT Baker	9834-03	LC / MS di grado