Articolo metodologico

Campionamento umana peptidoma Indigenous Saliva Utilizzando un Lollipop-Like Probe ultrafiltrazione: Semplificare e migliorare la rilevazione Peptide per spettrometria di massa Clinica

DOI:

10.3791/4108

⸱

7 agosto 2012

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Considerando campionamento saliva per il futuro l'applicazione clinica, un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) la sonda è stato fabbricato per adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi diretta di saliva non digerito da nanoLC LTQ-spettrometria di massa ha dimostrato la capacità di sonde LLUF per rimuovere le proteine ​​di grandi dimensioni e di proteine ​​ad alta abbondanza, e rendere a basso abbondanti peptidi più rilevabile.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anche se saliva proteoma umano e peptidoma sono stati rivelati 1-2 sono stati identificati da majorly digerisce trittico di proteine ​​salivari. Identificazione di peptidoma indigeno di saliva umana senza preventiva digestione con enzimi esogeni diventa imperativo, in quanto i peptidi nativi nella saliva umana fornire i valori possibili per la diagnosi della malattia, prevedere la progressione della malattia, e monitorare l'efficacia terapeutica. Di un campione adeguato è un passo fondamentale per la valorizzazione di identificazione delle risorse umane peptidoma saliva indigena. I metodi tradizionali di campionamento saliva umana che coinvolge la centrifugazione per rimuovere i detriti 3-4 potrebbe essere troppo tempo per essere applicabile per uso clinico. Inoltre, la rimozione dei detriti mediante centrifugazione può essere in grado di pulire la maggior parte dei patogeni infetti e rimuovere le proteine ​​molto abbondante, che spesso ostacolano l'individuazione di peptidoma scarsa abbondanza.

Convenzionali approcci proteomici che pripalmente utilizzano bidimensionale elettroforesi su gel (2-DE) gel in coniugazione con in-gel digestione sono in grado di identificare molte proteine ​​saliva 5-6. Tuttavia, questo approccio non è in genere sufficientemente sensibile per rilevare peptidi / proteine ​​poco abbondanti. Liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS) proteomica base è una alternativa che può identificare proteine ​​senza preventiva 2-DE separazione. Sebbene questo approccio fornisce una maggiore sensibilità, deve generalmente campione prima pre-frazionamento 7 e pre-digestione con tripsina, che rende difficile per l'uso clinico.

Per aggirare l'ostacolo in spettrometria di massa dovuta alla preparazione del campione, abbiamo sviluppato una tecnica chiamata ultrafiltrazione capillare (CUF) sonde 8-11. I dati del nostro laboratorio hanno dimostrato che le sonde CUF sono in grado di catturare proteine ​​in vivo da diversi microambienti in animali in modo dinamico e minimamente invasiva 8 -11. N centrifugazione è necessario in quanto una pressione negativa viene creata semplicemente siringa ritiro durante il prelievo. Le sonde CUF combinati con LC-MS sono riusciti a identificare le proteine ​​trittico-digerite 8-11. In questo studio, abbiamo aggiornato la tecnica di campionamento ultrafiltrazione con la creazione di un lecca-lecca-like ultrafiltrazione (LLUF) sonda che può facilmente adattarsi nella cavità orale nell'uomo. L'analisi da LC-MS senza digestione con tripsina ha mostrato che la saliva umana indigenamente contiene molti frammenti peptidici derivati ​​da varie proteine. Campionamento saliva con sonde LLUF evitato centrifugazione, ma rimosso in maniera efficace molte proteine ​​abbondanza più grandi e più alta. I nostri risultati di spettrometria di massa ha evidenziato che molti peptidi poco abbondanti è diventato rilevabile dopo filtrare le proteine ​​più grandi con sonde LLUF. Individuazione di peptidi a basso saliva abbondanza era indipendente multi-fase di separazione campione con cromatografia. Per l'applicazione clinica, le sonde LLUF incorporanod con LC-MS potrebbero essere utilizzati in futuro per monitorare la progressione della malattia da saliva.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Creazione di sonde LLUF

  1. Le membrane polietersulfone (2 cm 2) sono stati sigillati con pale in polipropilene triangolo (University of California, San Diego) da membrane incollaggio con resina epossidica ai confini della palette. Una membrana carica negativamente polietersulfone con un peso molecolare cut-off (MWCO) a 30 kDa è stato utilizzato.
  2. Un tubo di Teflon fluorurato etilene-propilene (diametro interno / diametro esterno, 0.35/0.50 cm) è stato attaccato ad un cilindro di uscita di una paletta polipropilene triangolo modo che la sonda LLUF può essere collegato ad una siringa da 20 ml.
  3. Dopo l'ammollo la membrana polietersolfone nella saliva umana in un piatto di coltura (50 mm di diametro), la pressione negativa è stato creato da ritirare una siringa. La siringa con pressione negativa ha guidato il processo di ultrafiltrazione per il campionamento delle proteine ​​dalla saliva.
  4. Le sonde sono stati sterilizzati con alcool al 70% durante la notte prima dell'uso. Per dimostrare la chiusura, abbiamo posizionato le sonde LLUF in una soluzionezione contenente blu destrano (50 mg / ml) con una massa molecolare medio di 2.000 kDa per 2 h. L'assenza di blu destrano nei campioni raccolti indicato che non perda sviluppato durante la fabbricazione e la sonda di campionamento.

2. Saliva Collection

  1. Saliva tutto è stato raccolto da tre volontari sani (due maschi e una femmina di età compresa tra 20 e 40) che non prendono farmaci, senza evidenti segni di gengivite o cavità 6.
  2. Dopo aver sciacquato la bocca con acqua, i campioni di saliva intero sono stati raccolti da sputare, senza stimolazione chimica, in un ghiaccio raffreddato vaso.
  3. Tutti i campioni sono stati raggruppati e mantenuto in ghiaccio durante la procedura di raccolta.
  4. Subito dopo la raccolta, la saliva (200 pl) è stata applicata per il campionamento con sonde LLUF. Il campionamento è stato eseguito in una camera 4 ° C.
  5. Proteine ​​della saliva (1,0 mg / mL), con o senza raccolta LLUF della sonda sono stati direttamente esposti al nano LC-massa sAnalisi pectrometry senza digestione triptica. Le concentrazioni di proteina sono state determinate usando un Bio-Rad Protein Assay 12.

3. NanoLC LTQ-MS Analysis

  1. Dalle Nazioni Unite digerite campioni di saliva (5 pl) sono state caricate direttamente alla colonna di scarico del sistema Eksigent nanoLC dal campionatore automatico, utilizzando il 100% tampone A (2% di acido formico acetonitrile/0.1%). Il nanoLC on-line è stato accoppiato con uno spettrometro di massa LTQ Finnigan.
  2. Dopo il caricamento del campione e il lavaggio, la valvola è stata commutata e un 500 nl / min sfumatura lineare è stato consegnato alla trappola e la colonna di separazione (10 cm di lunghezza, 100 id micron, in-house piene di Synergi 4 micron C18). Il gradiente è 0-50% tampone B (80% acetonitrile/0.1% di acido formico) in 45 min.
  3. Le nanoLC-LTQ strumenti MS sono stati operati in modalità dati dipende da Xcalibur. MS / MS spettri dei quattro forti MS ioni sopra una intensità di 1 x 10 5 sono stati raccolti con esclusione dinamicaattivata e l'energia di collisione fissato al 35%.
  4. Ogni campione è stato eseguito due volte dal nanoLC-LTQ sistema di MS. I campioni di tre preparazioni separate sono stati utilizzati. Tali peptidi rilevabili in tre campioni separati sono stati elencati nelle tabelle 1 e 2 supplementari. Rappresentativa di nanoLC LTQ-MS è stato illustrato in Figura 3.

4. Analisi dei dati e la ricerca nel database di proteine

  1. Ogni file RAW è stato convertito in un file utilizzando mzXML Readw.exe.
  2. Il file mzXML è stato inserito in un stregone SEQUEST sistema a 2 e consultati in un database umano generato dal Centro nazionale corrispondente for Biotechnology Information (NCBI) database di proteine ​​utilizzando l'enzima non-specificità. La tolleranza di massa di ioni precursore è stato fissato a 1,5 Da. Una massa molecolare di 16 Da stato aggiunto al metionina per la ricerca differenziale per tenere conto di ossidazione.
  3. Dopo la ricerca SEQUEST, i risultati sono stati filtrati automaticamente, convalidato und visualizzata da PeptideProphet e ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet stima un completo probabilità (P), punteggio che un incarico peptide è "corretta" contro "corretto" sulle basi dei suoi punteggi SEQUEST (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) e ulteriori informazioni di ogni sequenza peptidica identificato. ProteinProphet calcolato un punteggio di probabilità 0-1 per ogni proteina sulla base di peptidi assegnati MS / MS.
  4. Per ridurre al minimo i falsi positivi identificazioni abbiamo utilizzato rigorosi criteri di filtro. Innanzitutto, il minimo cutoff punteggio P è fissato a 0,8 per ogni peptide accettata per assicurare errore molto bassa (meno di 3%) e sensibilità ragionevolmente buona. In secondo luogo, tutti i peptidi con> 0,8 punteggio P deve avere alte cross-correlazione (Xcorr) punteggi allo stesso tempo: 1.9, 2.2 e 3.0 per +1, +2, 3 e carica.

5. La rimozione dei batteri orali con sonde LLUF

  1. Per determinare la capacità di sonde LLUF per rimuovere l'batteri orali, la saliva prima e dopo la raccolta LLUF sonda (sezione 3) è stato diffuso su piastre di agar per la rilevazione batterica.
  2. I batteri aerobici sono state fatte crescere su un antibiotico-free Lauria-Bertani (LB) piastra di agar a 37 ° C per un giorno.
  3. I batteri anaerobici sono state coltivate su un antibiotico senza piastra di agar brodo Brucella (BD, Sparks, MD) in condizioni anaerobiche con Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C per un giorno.

6. Risultati rappresentativi

1. Fabbricazione di sonde LLUF e saliva di campionamento in un ambiente imitato orale

Se la saliva di campionamento può essere eseguita come succhiare un lecca-lecca, la procedura permetterà di evitare il degrado di saliva sputato in dispositivi di raccolta 13-14. È importante sottolineare che sarà anche diventato possibile monitorare i pazienti in modo dinamico e localmente dalla cavità orale. Inoltre, se la preparazione del campione utilizzando saliva potrebbe essere semplificata, medici sarebbe facilmente facilitate la procedura per accelerare la loro decisione sulla successiva operazione clinica. La spettrometria di massa è una delle tecniche più sensibile per rivelare e anche proteine ​​di sequenza in un periodo di tempo molto breve. Tuttavia, le procedure complicate per la preparazione del campione hanno impedito di utilizzare questa tecnica in clinica. Inoltre, è noto che le proteine ​​abbondanza superiore o proteine ​​con pesi molecolari elevati in campioni clinici (amilasi ad esempio in saliva) proteine ​​abbondanza maschera cost a spettrometria di massa, 15-16. Per superare gli ostacoli di cui sopra, abbiamo sviluppato un lecca-lecca-come il dispositivo di ultrafiltrazione nome sonde LLUF (Figura 1). Una membrana carica negativamente polietersulfone con MWCO a 30 kDa (Figura 1A, a) è stato incollato ad una pala di polipropilene (Figura 1A, B). È stato posizionato davanti della sonda LLUF con l'intenzione di filtrare proteine ​​più grandi nella saliva. Per simulare l'ambiente umano per via orale (Figura 1A, g), Una spugna (Figura 1A, e) è stato impregnato in saliva in un piatto di coltura (Figura 1A, f). Dopo completare il disimpegno della siringa (Figura 1A, d), saliva filtrato iniziato a muoversi lungo un tubo di collegamento (Figura 1A, c) ed è stato raccolto.

2. Identificazione di peptidoma saliva indigena da nanoLC LTQ-MS

Confrontando LC cromatogrammi, abbiamo trovato cromatogrammi distinte di saliva prima e dopo il prelievo LLUF (figura 2), che indica che ci sono composizioni proteiche differenti in saliva LLUF dopo la campionatura. Per determinare le composizioni proteiche, abbiamo impiegato nanoLC LTQ-spettrometria di massa che è noto per poter prontamente peptidi di sequenza da una miscela proteina multipla. Ancora più importante, per semplificare la preparazione dei campioni per scopi clinici, saliva intero senza chimica o digestione enzimatica è stata applicata per nanoLC-LTQ analisi MS. Inaspettatamente, 131 peptidi chere identificato nella saliva non digerito (Supplemental Tabella 1). Questi peptidi sono frammenti derivati ​​da varie proteine ​​ricche di prolina, actina, alfa amilasi, alfa 1 globina, beta globina, histain 1, cheratina 1, mucina 7, recettore di immunoglobulina polimerica, satherin, e S100A9. Ventisei peptidi unici sono stati identificati nella saliva dopo filtrazione con sonde LLUF supplementare (Tabella 2). Questi peptidi sono principalmente frammenti derivati ​​da varie proteine ​​ricche di prolina. Peptidi derivati ​​da proteine ​​come il recettore di immunoglobulina polimerica (83.24 kDa) e alfa amilasi, erano rilevabili, dimostrando la capacità di sonde LLUF in rimozione di proteine ​​più grandi e abbondante. A MS / MS spettro del peptide PFIAIHAEAESKL corrispondente ad un peptide interna di alfa-amilasi è illustrata in Figura 3A. Più intrigante, dopo aver tolto grandi proteine, 18 di 26 peptidi sequenziato è diventato rilevabile nella sonda-campione saliva LLUF (Tabella1). Questi 18 peptidi sono stati derivati ​​da proteine ​​ricche di prolina o proteine ​​ipotetici conclusesi con una prolina (P) -. Glutammina (Q) (-PQ),-SR,-SP-PP o C-terminale figura 3B mostrato una MS / MS spettro del peptide PQGPPQQGGHPRPP che è stato rilevato nella sonda-campione saliva LLUF. Il peptide può essere derivato da proteine ​​sottofamiglia prolina-ricca HaeIII 1 e 2 (Tabella 1).

figure-protocol-1
Figura 1. Composizioni di sonde LLUF e campionamento di saliva umana intero da imitare cavità orale Pannello A: (a) un semi-permeabile polietersulfone con MWCO di 30 kDa, (b) una paletta polipropilene, (c) un tubo di Teflon fluorurato etilene-propilene; (d) una siringa da 20 ml Pannello B:. una spugna (e) (una linguetta mima) è stato impregnato in una piastra di coltura (f) contenente saliva umana per creareartificiale umana cavità orale (g). La pressione negativa risultante creato da completare il disimpegno una siringa spinge il fluido raccolto per muoversi lungo un tubo collegato (freccia) e verso uno spazio creato (freccia) all'interno della siringa. Bar: 2.0 cm.

figure-protocol-2
Figura 2. Differenziale LC / MS / MS cromatogrammi di saliva prima e dopo il campionamento LLUF. Proteine ​​(1,0 pg / pl) in saliva umana intero sono state filtrate senza o con una sonda LLUF. Proteine ​​senza digestione triptica stati direttamente sottoposti a nanoLC LTQ-MS che è stato coniugato con un sistema Eksigent Nano LC come descritto in Materiali e Metodi. La base di punta cromatogrammi (con 44-mim tempi di ritenzione) di saliva prima (A) e dopo (B) LLUF di campionamento sono state illustrate.

figure-protocol-3
Figura 3. DATECzione di peptidoma saliva da nanoLC LTQ-MS. sequenziamento proteine ​​della saliva prima (A) e dopo (B) il campionamento con sonde LLUF sono stati analizzati mediante nanoLC LTQ-MS come descritto nelle procedure sperimentali. Peptidoma saliva derivata da naturale saliva umana senza digestione triptica sono stati dimostrati nelle tabelle 1 e 2 supplementari. Un peptide (PFIAIHAEAESKL) derivato da alfa-amilasi è stata rilevata esclusivamente in un campione di saliva raccolta senza con sonde LLUF (A), che illustra la capacità di sonde LLUF nella rimozione di proteine ​​grandi. Molti peptidi con-PQ,-SR,-SP-PP o C-terminali erano esclusivamente in campioni dopo sonde LLUF ultrafiltrazione. One (PQGPPQQGGHPRPP) di peptidi derivati ​​da varie proteine ​​ricco in prolina hanno mostrato (B). MS / MS con la caratteristica "y" e "B" ioni della serie ha confermato le identità di entrambi i peptidi.

figure-protocol-4
Figura 4. rimozione dei batteri orali che utilizzano sonde durante LLUF. Una sonda LLUF stato costruito come descritto in Materiali e metodi. La sonda è stata posizionata nella saliva umana in un ambiente imitato orale (Figura 1). La siringa di fine LLUF sonda è stata ritirata per creare una pressione negativa che ha portato il processo di ultrafiltrazione per il campionamento saliva. Durante il campionamento, saliva intera attraversato selettivamente attraverso la membrana polietersolfone e accumulato all'interno di una siringa. Saliva intera prima del campionamento con una sonda LLUF serviva come controllo. Saliva (10 pl) prima e dopo il campionamento LLUF sonda è stata sparsa su piastre di agar per il rilevamento batterica Panel A:. Saliva con (+ LLUF) e senza (+ LLUF) LLUF campionamento sonda è stata diffusa fianco a fianco su un antibiotico-free LB piastra di agar a 37 ° C per un giorno Panel B:. saliva con e senza campionamento LLUF sonda è stata spalmata su un antibiotico senza piastra di agar brodo Brucellain condizioni anaerobiche mediante Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C per un giorno. I batteri non sono cresciuti su piastre di agar si sviluppa con LLUF sonda-campione di saliva, dimostrando la capacità di sonde LLCF nell'eliminazione aerobica e anaerobica dei batteri orali. Bar: 1.0 cm.

Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
Sequenza peptidica / massa peptide misurato Numero di adesione Nome
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2.485,3 		gi | 41349484 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 2 precursore
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1.576,9 		gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3.126,2 		gi | 37537692 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 4 precursore
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2.028,3 		gi | 113423660 Previsto: proteina ipotetica
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2.077,8 		gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​BstNI sottofamiglia 1 isoforma 1 precursore
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349484 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 2 precursore
gi | 41349486 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 3 precursore
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2.918,5 		gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2.131,3 		gi | 113423660 Previsto: proteina ipotetica
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030 		gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1.866,6 		gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1.713,8 		gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
gi | 4826944
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2.083,1 		gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2.512,6 		gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2.720,2 		gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 113423663 Previsto: HYproteine ​​pothetical
14 PQGPPQQGGHPRPP
1.450,1 		gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1.791,1 		gi | 4826944 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 2
gi | 9945310 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia HaeIII 1
16 SPPGKPQGPPPQ
1.186,9 		gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349484 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 2 precursore
gi | 41349486 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 3 precursore
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2.720,3 		gi | 113423663 Previsto: proteina ipotetica
gi | 41349482 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 1 isoforma 1 precursore
gi | 113423262 Previsto: isoforma proteica ipotetica 5
gi | 60301553 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1.870,9 		gi | 37537692 Proline-ricchi di proteine ​​sottofamiglia BstNI 4 precursore

Peptidi Tabella 1. Erano esclusivamente rilevabile in LLUF-raccolto campioni.

Tabella supplementare 1. Clicca qui per vedere Tabella 1 supplementare .

Tabella supplementare 2. Clicca qui per vedere Tabella supplementare 2 .

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo scoperto che esistono molti frammenti peptidici in saliva umana non digerito. Questi frammenti peptidici sono derivati ​​dalle varie forme di prolina ricchi di proteine, actina, alfa amilasi, alfa 1 globina, beta globina, histain 1, cheratina 1, mucina 7, del recettore immunoglobuline polimerico, satherin, S100A9. Ci possono essere molti fattori che contribuiscono alla produzione di peptidi con siti di clivaggio indeterminato. Per esempio, alcuni frammenti peptidici possono essere naturalmente presenti in tutta ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Grants Salute (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 e R21-I58002-01). Ringraziamo C. Niemeyer per la lettura critica del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo Comments
Polietersolfone membrane Pall Corporation 30 kDa MWCO
Teflon fluorurato etilene propilene tubo Upchurch Scientific
Blu destrano Sigma
Nano sistema LC Eksigent
Trap colonna C18 Agilent 5065-9913
LTQ lineare trappola ionica Spettrometro di massa Thermo Fisher
Stregone 2 Sage-N Research
Acetonitrile-0.1% di acido formico JT Baker 9832-03 LC / MS di grado
Acqua 0,1% di acido formico JT Baker 9834-03 LC / MS di grado

Riferimenti

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