Nanotopology dell'adesione cellulare su angolo di inclinazione variabile Microscopia Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM)

Summary

Topologia di adesione cellulare su un substrato viene misurata con precisione nanometrica variabile-angolo microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (VA-TIRFM).

Abstract

Topologia superficiale, ad esempio di cellule che crescono su un substrato, è determinata con precisione nanometrica Variable-Angle Microscopy Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM). Cellule sono coltivate su vetrini trasparenti ed incubate con un marcatore fluorescente omogeneamente distribuiti nella loro membrana plasmatica. L'illuminazione avviene mediante un raggio laser parallelo sotto angoli variabili di riflessione interna totale (TIR) ​​con differenti profondità di penetrazione del campo elettromagnetico evanescente. Registrazione di immagini di fluorescenza upon irradiazione a circa 10 diverse angolazioni permette di calcolare cellula-substrato distanze con una precisione di pochi nanometri. Differenze di adesione tra varie linee cellulari, cellule tumorali e cellule es meno maligne, sono così determinato. Inoltre, eventuali modifiche di adesione cellulare su di trattamento chimico o fotodinamica può essere esaminato. In confronto con altri metodi di super-risoluzione microscopia luce di esposizione rimanedanni molto piccola, e non di cellule viventi ci si aspetta.

Introduction

Quando un fascio di luce che si propaga attraverso un mezzo di indice di rifrazione n ₁ incontra un'interfaccia ad un secondo mezzo di rifrazione n ₂ 1, riflessione interna totale avviene a tutti gli angoli di incidenza Θ, che sono maggiore dell'angolo critico Θ = _c arcsin (n ₂ / n _1). Nonostante sia totalmente riflesso del fascio di luce incidente evoca un campo evanescente elettromagnetico che penetra nel secondo mezzo e decade esponenzialmente con la distanza z perpendicolare dall'interfaccia secondo I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corrisponde all'intensità del....

Protocol

1. Semina ed incubazione di cellule

1. Seme singole cellule, per es U373-MG o U-251-MG cellule di glioblastoma ad una densità tipica di 100 cellule / mm ² su un vetrino e farle crescere per 4872 ore in terreno di coltura (per es RPMI 1640 integrato con 10% siero di vitello fetale e antibiotici) utilizzando un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Incubare le cellule con un marcatore di membrana, per esempio 6-dodecanoile dimetilammino-2-naftalene (laurdan) applicata per 60 minuti ad una concentrazione di 8 mM (in mezzo di coltura) ^4, o un marcatore citoplasma, ad esempio calceina aceto....

Discussion

Un metodo è descritto per cella di misura-substrato distanze con precisione nanometrica. Attualmente, i metodi di super-risoluzione microscopia, ad esempio sulla base di illuminazione strutturata ⁷ o ^8-10 singoli rilevazione molecola nonché deplezione emissione stimolata (STED) microscopia ¹¹ sono di notevole interesse. Nessuna di queste tecniche, tuttavia, consente una risoluzione assiale inferiore a 50 nm. Inoltre, irradianza piuttosto elevato di 50.100 W / cm ² è n.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Tipo	Commenti
Incubatrice	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
A flusso laminare	Holten sicuro	S2010 1.2 IT GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% di penicillina / streptomicina	Biochrom		Coltivazione media
Vetro oggetto diapositive	Marienfeld	Pure vetro bianco	Pulizia Procedura speciale utilizzato
6-dodecanoile dimetilammino-2-naftalene (laurdan)	Molecular Probes		Marcatore fluorescente (soluzione stock: 2 mM in etanolo)
Microscopio	Carl Zeiss	Axioplan 1
Diodo laser	PicoQuant	LDH 400 con autista PDL 800-B	Lunghezza d'onda: 391 nm
Singola modalità del sistema di fibra	Punto di Origine	kineFlex	Usato con ottiche collimanti
EMCCD fotocamera	Andor	DV887DC	Fotocamera posteriore illuminato