Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

Summary

Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Abstract

L'interrogazione di espressione genica delle cellule beta e funzione in vitro è spostato esattamente negli anni dallo studio di linee cellulari tumorali roditore allo studio di isole isolate roditori. Isole principali offrono il vantaggio che più rispecchiano fedelmente la biologia di vie di segnalazione intracellulare e risposte secretorie. Considerando che il metodo di isolamento delle isole utilizzando tessuti dissociando enzimatici (TDE) preparativi è stato ben definito in molti laboratori di ^1-4, le variazioni nella consistenza della resa delle isole e di qualità da qualsiasi ceppo roditore dato limitare la portata e la fattibilità di studi delle isole principali. Queste variazioni si verificano spesso come risultato delle TDES grezzi parzialmente purificati utilizzati nella procedura di isolamento isolotto; TDES spesso presentano lotto a lotto variazioni nell'attività e spesso richiedono adattamenti della dose di enzima impiegato. Un piccolo numero di report hanno utilizzato purificato TDES per isolamenti cellulari roditore ^{5, 6} 7, 8, in cui vengono perfuse le TDES direttamente nel dotto pancreatico di topi, seguito da frazionamento tessuto greggio attraverso un gradiente Histopaque ^9, e l'isolamento di isolotti purificato. Una differenza significativa nel nostro protocollo è l'uso di collagenasi purificata (CI zyme MA) e neutro proteasi (CI zyme BP) combinazione. La collagenasi è caratterizzato dall'uso di un collagene ⁶ degradante attività di fluorescenza (CDA) saggio che utilizzato contrassegnati in modo fluorescente solubili fibrille vitello come substrato ^6. Questo substrato è più predittiva della cinetica di degradazione del collagene nella matrice del tessuto perché si basa su collagene nativo come substrato. La proteasi è characterized con un sensibile test di fluorescenza cinetica ^10. Utilizzando questi saggi migliori insieme con la più tradizionale analisi biochimiche consentire la TDE da produrre in modo più coerente, con conseguente miglioramento delle prestazioni la coerenza tra i lotti. Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per la massima resa isolotto e morfologia isolotto ottimale utilizzando topi C57BL / 6. Durante lo sviluppo di questo protocollo, diverse combinazioni di collagenasi e proteasi neutre stati valutati a diverse concentrazioni, e il rapporto finale di collagenasi: proteasi neutra di 35:10 rappresenta enzima prestazioni paragonabili a Sigma tipo XI. Poiché significativa variabilità delle rese insule media da diversi ceppi di topi e ratti sono stati riportati, ulteriori modifiche della composizione TDE dovrebbe essere fatto per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da diverse specie e ceppi.

Protocol

A. Materiali necessari: vedere la tabella 1 (reagenti) prima della preparazione

1. HBSS (P / S): 100 HBSS 10X ml + 900 ml di H ₂ 0 + 1% di penicillina / streptomicina (conservato in frigorifero o tenuta in ghiaccio).
2. 20% magazzino BSA è fatto in acqua e aliquotati e conservati a -20 ° C.
3. HBSS (BSA): 200 ml HBSS 1X (P / S) + 3 ml di 20% BSA (concentrazioni finali BSA 0,3%)
4. Islet media: RPMI + 10% FBS + glutammina 1% + 1% penicillina / streptomicina
5. Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque
6. Sutura 4-0 (McKesson): tagliato in 2 pezzi ¾ pollici e conservati in una capsula di Petri cm 10
7. Strumenti: Piegare la pinza da Strumenti Scienza Belle a 90 °, e limare i denti seghettati di tutte e tre le coppie di pinze. L'obiettivo è quello di attutire i denti, non per rimuoverli.
8. Cannula per la somministrazione di collagenasi / proteasi miscela: 27G ½ pollici aghi, 30 ½ polliciago, PE50 tubi tagliati a 12 in pezzi. File entrambi gli aghi fino ad una estremità arrotondata liscia che non presenta spigoli vivi. Inserire l'ago 27G in una estremità di un 12 pollici pezzo di tubo PE50. Rimuovere l'ago 30G dal corpo rompendo l'involucro con un paio di pinze, ruotando il corpo di ¼ di giro ogni volta. Rimuovere l'ago con le pinze dall'involucro e inserirlo nella estremità del tubo PE50 sotto un microscopio di dissezione. Assicurarsi di non piegare il tubo quando si inserisce l'ago nel tubo PE50. L'ago 27G è la fine che si allega la siringa di collagenasi.
9. Collagenasi (CI zyme MA) e Neutral proteasi (enzima CI BP). Ricostituire il TDE le istruzioni del produttore. Fare riferimento al Certificato lotto specifico di analisi per calcolare la concentrazione dell'enzima attività. Trasferimento per un totale di 350.000 degradanti attività collagene (CDA) unità della collagenasi ricostituito e 100.000 unità di proteasi neutre del reconstitbuite Protease BP in una provetta conica e si diluisce a 15 ml in totale HBSS (P / S)

B. Step-by-Step protocollo

1. L'inflazione di pancreas con collagenasi / Proteasi Miscela

1. Eutanasia del mouse per dislocazione cervicale, saturare il busto del mouse con il 70% EtOH, aperta cavità addominale completamente da ano a membrana con le forbici di dissezione e pinze.
2. Posizionare il mouse sulla piattaforma di un microscopio di dissezione.
3. Tirare il cieco e del colon ascendente fuori e metterli al di fuori della cavità del corpo alla vostra sinistra. Vedere la Figura 1 per una sintesi dei seguenti passaggi.
4. Posizionare i lobi del fegato contro il diaframma, che devono rimanere lì se la cavità corporea è aperto abbastanza lontano. Trova l'arteria epatica, la vena porta ed il dotto biliare fagotto che porta nel fegato afferrando il duodeno con pinze curve. Con un'altra coppia di pinze curve, mani sotto la vena arteria, e condotto bundle e tirare un 2 ¾ in pezzo di filo di sutura 4-0 sotto, arteria vena, dotto biliare e legare una volta e tirare il più vicino al fegato il più possibile.
5. Utilizzando due coppie di pinze curve, accuratamente afferrare il duodeno e trovare il dotto biliare attaccato al duodeno al papilla. Utilizzare una pinza della pinza per colpire attraverso il pancreas e proprio tessuto connettivo sotto la chiusura dotto biliare alla papilla. Ficcare il forcipe rapidamente attraverso l'organo di fare un buco e poi mettere entrambe le pinze di pinza attraverso e prendere un altro 2 ¾ pollici pezzo di filo di sutura 4-0 e legarlo con una volta e tirarlo in un piccolo cerchio, ma non tirare.
6. Passare alla 90 ° pinze e le forbici Superfine Vännäs. Con i 90 ° pinza, pizzicare e tirare con cura l'intestino tenue fino a quando il dotto biliare è teso. Fai un taglio orizzontale attraverso la papilla con le forbici a coltellate le forbici aperte nell'intestino e poi il taglio con un unico movimento. Provate a fare solo one attraversano la papilla senza staccare il dotto biliare dalla papilla.
7. Tenendo ancora l'intestino con le pinze 90 °, inserire la cannula nel dotto biliare fino a metà della lunghezza del dotto biliare, e quindi estrarre delicatamente la sutura stretto intorno alla cannula.
8. Riempire una siringa da 3 ml con 2,0 ml di collagenasi / proteasi o della miscela e iniettare nella cannula ad un passo lento e costante.
9. Dopo l'inflazione del pancreas, rimuovere cannula dal dotto biliare e utilizzare le pinze curve e forbici a molla curve per rimuovere il pancreas gonfio iniziando dal colon discendente e snipping il tessuto connettivo, come si tira su l'intestino. Continuare a rimuovere il pancreas dall'intestino fino a raggiungere il dotto biliare, quindi rimuovere il pancreas dalla milza, poi lo stomaco e poi dai visceri della cavità addominale. Completare la rimozione tagliandoli via i punti di sutura. Aggiungere il pancreas a una provetta da 50 ml contenente 5 ml di HBSS(P / S). Questo tubo deve essere su ghiaccio.
10. Ripetere la procedura per ogni animale fino a quattro animali. Per ottenere risultati ottimali, si dissociano solo quattro pancreas contemporaneamente. In genere, mentre i primi quattro sono in 37 ° C bagno d'acqua, si gonfia un altro pancreas quattro.

2. Pancreas dissociazione

1. Posizionare le provette da 50 ml contenenti il ​​pancreas in un bagno di acqua 37 ° C per 15 min.
2. Agitare delicatamente il tubo e verificare la dissociazione dei tessuti, assicurati tessuto si smonta facilmente, quindi agitare il tubi di 12 volte mentre si sta tenendo il tubo con il coperchio.
3. Aggiungere non più di 30 ml di HBSS (BSA) (questo può essere una quantità inferiore, a seconda di quanto è necessario per bilanciare i tubi per la fase di centrifugazione), e centrifugare a 290 xg per un min.
4. Aspirare il surnatante con cura e lasciare una piccola quantità di surnatante (2-3 ml) in basso in modo da non disturbare il pellet.
5. Usando una siringa da 30 ml attached a 14G ago, aggiungere non più di 10 ml di HBSS (BSA) e aspirare la sospensione su e giù per 2 volte.
6. Filtrare la miscela cellulare attraverso un colino di plastica in una provetta da 50 ml e lavare con altri 10 millilitri HBSS (BSA).
7. Centrifugare a 330 xg per 2 minuti.
8. Sopranatante e invertire tubi di scarico su un tovagliolo di carta assorbente per 1 min.
9. Risospendere ogni provetta in 10 ml di freddo 1100 HISTOPAQUE.
10. Sovrapporre il HISTOPAQUE con 10 ml di HBSS (BSA) e centrifugare a 900 xg per 18 min.
11. Rimuovere l'intero 20 ml di surnatante con un ampio passaggio pipetta 25 ml e passare il surnatante attraverso un filtro invertiti 70 pm.
12. Sciacquare le isole in una piastra da 10 cm Petri pipettando 10 media delle isole ml attraverso il filtro tenendolo a destra verso l'alto sopra il piatto.
13. Cultura gli isolotti a 37 ° C, 5% di CO ₂ coltura tissutale incubatore fino al momento per la sperimentazione. In genere, le isole sono raccolte a mano e contate prima di compeimentation.

3. Risultati rappresentativi

Rendimenti Islet, morfologia, e la qualità sono i parametri generali utilizzati per valutare il successo di isolamento delle isole. Nelle nostre mani, rese isolotto dalla media C57BL / 6 topo sono nella gamma di 150-250 isolotti usando questo protocollo (vedere Tabella 2), e sono paragonabili ai dati ottenuti usando ottimizzato Sigma collagenasi tipo XI. Tuttavia, le rese possono variare a seconda del ceppo di topo utilizzato e l'età del mouse. La maggior parte degli animali che utilizziamo sono nella fascia di età 8-16 settimane Questo protocollo è stato testato su diversi ceppi di topi, compresi C57BL / 6 (180-250 isole / topo), CD1 (200-300 isole / topo), 129 / B6 (200-300 isole / mouse), BLKS-db/db (120-200 isole / mouse), NOD (10 settimane di età, 100-150 isole / mouse), e NOD-SCID (100-150 isole / topo ). Isolotto morfologia tipica è mostrata in figura 2, in cui isole hanno un ciclo di forma allungata, con dimensioni relativamente uniforme (anche se le dimensioni uniformity può variare da ceppo a ceppo). La figura 3 mostra la nostra analisi tipica di glucosio-stimolata la secrezione di insulina da C57BL / 6 isole di topo isolate utilizzando TDES purificati vs Sigma collagenasi tipo XI. Tipicamente, una elevata qualità dei risultati delle isole preparazione in una stimolazione di insulina a 25 mM di glucosio che è 6-20 volte maggiore di quello osservato con 2,5 mM di glucosio. Altre applicazioni possono anche essere utilizzati per verificare la qualità di isole isolate, e questi includono l'uso di tecniche perifusion, Ca ^{2 +} imaging (con Fura2), e trascrizione inversa PCR, tra gli altri ^11.

Figura 1. Una sintesi della cannulazione del dotto biliare.

Figura 2. Aspetto tipico delle isole C57BL / 6 a 24 ore di isolamento seguente. Immagini sono state acquisite su un amicroscopio convertito con ingrandimento 40X.

Figura 3. Glucosio secrezione di insulina stimolata di C57BL / 6 isole. At 24 hr isolamento seguente, 100 isolotti sono stati incubati in un piatto da 12 pozzetti per 1 ora a 37 ° C in Krebs-Ringer Hepes tamponata soluzione contenente 2,5 mM di glucosio. Isolette sono state poi trasferite Krebs-Ringer Hepes a 2,5 mM di glucosio per una ulteriore ora, dopo che è stato raccolto il surnatante per la misura insulina utilizzando due immunospecifico sito enzimatico immunoenzimatico (ELISA) (Crystal Chem). Gli isolotti stessi sono stati successivamente trasferiti Krebs-Ringer Hepes-soluzione tamponata contenente 25 mM di glucosio, e il rilascio di insulina nel mezzo è stata misurata mediante ELISA dopo 1 ora di incubazione.

Discussion

In questo protocollo, abbiamo descritto la nostra procedura per l'incannulazione, perfusione con collagenasi, e la dissociazione del pancreas murino, con lo scopo di isolare le isole di Langerhans. Tecnicamente, il nostro metodo, una volta appreso, dovrebbe consentire l'isolamento del pancreas entro 4 min eutanasia degli animali, e per 1 ora dovrebbe comportare l'isolamento di isole da un singolo animale. La rapidità della tecnica ci permette di isolare isolotti da fino a 12 topi a un tratto tipico, ottenendo in tal modo l'isolamento di fino a 3.000 isolotti.

A differenza di altri protocolli che utilizzano preparazioni grezze di collagenasi, il nostro protocollo è caratterizzata dall'uso di proteasi purificata, CI zyme Collagenasi MA CI enzima proteasi e BP. Variazioni nella consistenza dei preparati TDE che sono commercialmente disponibili richiede che ciascun lotto singolarmente testato e ottimizzato prima uso generale. Questo lotto a lotto variabilità ci ha portato a prendere in considerazione l'uso di PuriTDES cati da VitaCyte. Questi TDES altamente purificate sono caratterizzati da più metodi tra cui l'uso di sensibili saggi fluorescenza substrato marcato. Il saggio di fluorescenza CDA è più sensibile alle diverse forme molecolari di collagenasi che hanno differenti cinetiche in degradante collagene nativo. Saggi storici substrato peptidico fornire una valutazione incompleta di collagenasi. Caratterizzare collagenasi con metodi diversi assicura una maggiore attività enzimatica tra i lotti.

Sulla base della nostra in-house test utilizzando una varietà di preparazioni collagenasi disponibili in commercio, abbiamo trovato che le combinazioni di enzimi purificati prodotto riproducibili da lotto a lotto risultati. I vantaggi principali di usando TDES altamente purificata e rigorosamente caratterizzato in questa applicazione sono una composizione enzimatica ottimale è definito, il lotto a lotto costanza delle prestazioni è assicurato. Tale coerenza elimina il laborioso processo di qualificazione partita normalmente richiestocollagenasi per prodotti grezzi o arricchito. TDES purificati anche consentire ulteriori modifiche della composizione per migliorare la resa e la qualità di isolotti recuperati da differenti ceppi di topi. Notifica composizioni enzimatiche ottimali per l'isolamento di isolotti da diversi ceppi di topi possono essere più efficacemente comunicata. Questo, a sua volta, porta ad un uso più produttivo delle risorse e maggiore flessibilità nel disegno sperimentale.

Ci sono molti passaggi critici che possono influenzare il risultato di isolamenti delle isole con il nostro protocollo. La prima è la necessità di ottenere un gonfiaggio efficace del pancreas durante la perfusione del preparato enzimatico. È importante iniziare il gonfiaggio con forza dolce sulla siringa, e aumentare la forza come si gonfia pancreas. E 'utile per spostare l'intestino e sollevare il pancreas durante il gonfiaggio in modo che la collagenasi perfusione l'intero organo. Un altro passo importante è la forza con cui si scuote il afte tubir incubazione a 37 ° C (fase 2.2). Abbiamo trovato che scuotendo il pancreas duro contro il tappo della provetta provoca frammentazione di isolotti, ma senza alcuna forma di dissociazione meccanica in questa fase, i rendimenti insule può cadere drammaticamente. È inoltre indispensabile che durante la fase di dissociazione con la siringa (passo 2.5), un livello medio forza viene applicata durante il movimento su e giù con lo stantuffo, questo assicura un'adeguata dissociazione tessuto prima della fase di filtrazione (2,6), dove poco il tessuto deve essere trattenuta dal filtro colino da tè. Infine, l'ultimo passo da seguire con attenzione è l'aspirazione di tutta la 20 ml delle isole HISTOPAQUE frazionati. Anche se isole sono in genere a livello di interfaccia del HISTOPAQUE e HBSS, abbiamo scoperto che si perde isole quando cerchiamo di rimuovere solo l'interfaccia, invece, ora rimuovere l'intero 20 ml con un ampio passaggio pipetta 25 ml. Abbiamo aggiunto la filtrazione attraverso il filtro inverso 70 micron (passo 2.11) per eliminare la necessità di centrifuge le isolette più volte per lavare via il HISTOPAQUE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda		Catalogo #
HBSS 10X	Life Technologies	14065
RPMI	Fisher Scientific	10-040
BSA	Sigma Aldrich	qualsiasi
Histopaque 1077	Sigma Aldrich	10771
Histopaque 1119	Sigma Aldrich	11191
4-0 sutura 100 m rotolo	McKesson	451521
14 g smussato 'ago	Fisher Scientific	14-8216M
Vännäs Superfine SCISS	Fisher Scientific	501778
Forbici curve Primavera	Fisher Scientific	14127
Pinze curve (2)	Fisher Scientific	15914G
Pinze curve (di 90 °)	Strumenti Scienza Belle	11052-10
27G mezzo ago pollici	Fisher Scientific	305109
30G ago 1/2 pollice	Fisher Scientific	305106
PE tubo	Becton Dickinson	427411
Collagenasi MA	Vitacyte, LLC	001-2030
BP Proteasi	Vitacyte, LLC	003-1000
3 ml siringa	Fisher Scientific	309585
Siringa da 30 ml	Fisher Scientific	309650
70 pm filtro	Fisher Scientific	352350
10 cm 2 Petri	Fisher Scientific	351005
Tè colino in plastica	Ogni cucina di alimentazione
			Reagenti Tabella 1. E attrezzature
			Sigma tipo XI (L010M8618) MA (100615) BP (110329) MA (081104) BP (100823) MA (091211) BP (101109) 216 (± 74) 260 (± 45) 157 (± 37) 200 (± 4)
			Tabella 2. Rendimenti isole media (± DS) con un sacco TDE diverse * * I dati rappresentano i rendimenti medi delle isole di almeno 10 topi. I numeri di lotto tra parentesi