Fabbricazione e applicazione di Rosa Bengala-chitosano Films in riparazione dei tessuti Laser

Sommario

Le suture sono di solito necessari per riparare il tessuto durante gli interventi chirurgici. Tuttavia, la loro applicazione può essere problematico in quanto sono invasivi e possono danneggiare il tessuto. I metodi di fabbricazione e l'applicazione di un adesivo tessuto romanzo sono qui riportati. Questo film adesivo viene laser-attivata e non richiede l'uso di suture.

Abstract

Bonding tessuto fotochimica (PTB) è una tecnica di sutura per la riparazione dei tessuti, che si ottiene applicando una soluzione di rosa bengala (RB) tra ^1,2 tissue due bordi. Questi sono poi irradiata da un laser che viene selettivamente assorbito dal RB. La reazione risultante fotochimiche presumibilmente reticolare le fibre di collagene nel tessuto con minima produzione di calore ^3. In questo rapporto, RB è stato inserito nel film sottili di chitosano per fabbricare un adesivo nuovo tessuto che è laser-attivato. Pellicole adesive, a base di chitosano e contenente RB ~ 0,1% in peso, sono fabbricati e incollate intestino di vitello e nervi tibiale ratto da un laser a stato solido (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / cm ^2, spot size ~ 0,5 cm) . Una colonna singola tensiometro, interfacciato con un personal computer, viene utilizzato per testare la resistenza della giunzione. Le RB-chitosano legami adesivi con fermezza verso l'intestino con una forza di 15 ± 6 kPa, (n = 30). La resistenza di adesione scende a 2 eplusmn; 2 kPa (n = 30), quando il laser non viene applicato l'adesivo. L'anastomosi di nervi tibiali possono essere anche completata senza l'uso di suture. Un romanzo chitosano adesivo è stato fabbricato che legami fotochimicamente al tessuto e non richiede suture.

Protocollo

1. Chitosano adesivo Preparazione

1. La polvere chitosano è solubile in soluzione di acido acetico, per la preparazione di una soluzione stock di acido acetico (2% v / v), aggiungere 10 ml di acido acetico glaciale a 490 ml di acqua deionizzata (DI-H ₂ O).
2. Per la preparazione di una soluzione stock di Rosa Bengala (RB) (0,01% w / v) in acido acetico, pesare 5 mg di RB in un flaconcino avvolto con un foglio di alluminio per evitare fotodecolorazione. Aggiungere 0,5 ml di DI-H ₂ O per sciogliere la polvere poi aggiungere 49,5 ml di soluzione di acido acetico magazzino (descritte nella sezione 1.1).
3. Per la preparazione della soluzione di chitosano (1,7% w / v), pesare 0,85 g di polvere di chitosano (MW medio, 85% grado di acetilazione) e aggiungere 50 ml di soluzione di acido acetico RB. Il controllo è stata preparata sciogliendo il chitosano in soluzione di acido acetico senza RB.
4. Aggiungere un agitatore magnetico alla miscela chitosano ed agitare a temperatura ambiente. Per garantire la completa dissoluzione dei componenti, mescolare il chitosanoin acido acetico + RB per due settimane e il chitosano in acido acetico per 5 giorni (controllo). Quando chitosano è dissolto, il pH della soluzione aumenta da ~ 2.6 a ~ 3.9. Notare che RB è scarsamente solubile in ambiente acido e richiede un aumento del pH della soluzione e un tempo esteso agitazione per scioglierli.
5. Centrifugare le soluzioni a 3270 xg per 1 ora e raccogliere il supernatante utilizzando, per esempio, una siringa da 10 ml sterile. Fare attenzione a non disturbare il pellet impurità. Durante questa fase, la soluzione viene pulito da impurità macroscopiche e materia insolubile.
6. Iniettare l'(centrifugato) soluzione di chitosano su una lastra di perpex piatto utilizzando una siringa sterile. Lo spessore del film essiccato dipende dal rapporto tra la quantità di soluzione erogata e la superficie su cui si sviluppa la soluzione. Assicurarsi che la soluzione è privo di bolle d'aria e distribuito uniformemente sulla lastra. Per ottenere film sottili con ~ 13 micron di spessore, iniettare ~ 1 ml di soluzione di oltre 12 cm ² di superficiezona (dimensioni ~ 3x4 centimetri, Figura 1A).
7. Coprire la lastra Perspex con uno schermo, in alluminio, ad esempio, per evitare fotodecolorazione della soluzione. Assicurarsi che la ventilazione è garantita abbastanza aria per asciugare la soluzione sotto lo schermo.
8. La soluzione viene lasciata asciugare a temperatura ambiente (25 ° C) e pressione (1 atm) finché la pellicola risultante è insolubile in acqua e non si gonfiano macroscopicamente. Questo è in genere raggiunto in 2 settimane.
9. Staccare le pellicole con cura usando una spatola sottile e piatto: questi film può essere facilmente staccata la lastra di perspex senza danneggiarli.
10. Misurare lo spessore dei film utilizzando un micrometro.
11. Tagliare l'adesivo in strisce rettangolari con una forbice affilata pulito e metterli tra le diapositive di vetro sterili per conservare la loro forma piatta. Avvolgere i vetrini in un foglio di alluminio per la luce schermatura e conservarli a temperatura ambiente. Etichettare gli adesivi con o senza RB come "rosa adesivo" o "adhes chitosanoive "rispettivamente.
12. La rosa pellicole adesive possono essere sterilizzati con etanolo (90%) o con raggi gamma (0,1 KGy / h per 24 ore) ^4,5.

2. Adesivo Attenuazione ottica

1. Fissare l'adesivo rosa all'interno di una cuvetta di quarzo.
2. Registrare il suo spettro attenuato nel range di 400 - 800 nm usando un spettrofotometro a doppio raggio ^4.
3. Assumendo la validità della legge di Beer, calcolare la lunghezza di attenuazione del collante nel modo seguente: I = I ₀ ^e-Ax dove ₀ è l'intensità del fascio incidente, 1 / A è la lunghezza di attenuazione, ed x è lo spessore del film.
4. Ripetere i passaggi 2,1-2,3 per l'adesivo chitosano per servire come controllo.

3 In applicazione in vitro:. Tessuto Bonding laser su Intestino

1. Intestino di vitello raccolta subito dopo l'eutanasia degli animali e conservare a -80 ° C.
2. Prima dell'uso, sbrinamento e idratare la tiUMERO immergendolo in DI-H ₂ O per 10 min.
3. Bisecare il tessuto in sezioni (2 x 1 cm) usando una lama di 10 ° sotto un microscopio operativo (x10). Mantenere l'umido sezioni con DI-H ₂ O.
4. Portare i monconi incisione vicini (end to end). Rimuovere l'acqua in eccesso dalla superficie con punte di cotone.
5. Posizionare una rosa nastro adesivo (10 x 6 mm) attraverso l'incisione sullo strato sierosa con microforceps assicurando pieno contatto con l'intestino (Figura 2).
6. L'adesione del tessuto adesivo rosa è attivato da un diodo-pompato laser a stato solido, che è accoppiato ad una fibra ottica multimodale (diametro del nucleo 200 micron) ^4.
7. Impostare il livello di potenza del laser a 180 mW e irradiare l'adesivo per ~ 6 min con un fascio di punto di ~ 5 mm, utilizzando i parametri elencati nella Tabella 1. Spot-irradiate l'adesivo garantire che ogni spot viene irradiata per ~ 5 secondi prima di spostare il fascio nel punto adiacente. Tla procedura garantisce che il raggio laser scansiona l'intera area superficiale dei tempi diversi adesivi.
8. Per valutare la resistenza di legame tessuto, fissare un campione a un tensiometro calibrato singola colonna (Instron, MA, USA) utilizzando i grip meccanico. Spostare i punti di presa a 22 mm / min fino a quando i due monconi del tessuto separati ^4.
9. Posizionare un adesivo rosa sul tessuto, come descritto nel passaggio 3,5. Non irradiare il campione e misurare la resistenza della giunzione del tessuto come descritto al punto 3.8. Questo esempio serve da controllo.

4 In applicazione Vivo:. Anastomosi nervo tibiale

1. Sedare il ratto Wistar con isoflurano / miscela O ₂ (4% durante l'induzione, 2% in seguito) ^5. Per via sottocutanea iniettare Buprenex (0,03 mg / kg) per fornire intra-operatoria attività analgesica e alleviare il dolore o disagio possibile.
2. La seguente procedura chirurgica deve essere effettuata con un microscopio operatorio (x10). Fai una pelle obliquaincisione di circa 3 cm di lunghezza nella parte dorso-laterale della coscia destra ed esporre il nervo tibiale con un muscolo-splitting approccio attraverso i muscoli glutei ^2.
3. Parzialmente sezionare e tagliare l'avventizia del nervo tibiale con rette micro-forbici e assorbire l'acqua in eccesso con garza sterile o batuffoli di cotone.
4. Tagliare il nervo tibiale con micro-forbici.
5. Posizionare una striscia sterile chitosano (dimensioni 5 x 4 mm) al di sotto del nervo tibiale utilizzando micro-pinza.
6. Approssimativo i monconi nervosi end-to-end con micro-pinza sulla striscia adesiva rosa.
7. La striscia aderisce completamente al nervo formando un collare, che può aiutare con la rotazione del nervo durante l'irradiazione laser della striscia.
8. Attivare la rosa adesivo con il laser, come descritto nei punti 3.6) e 3.7).
9. Tagliare l'adesivo ridondante alzò dal collare del nervo operato.
10. Chiudere i muscoli e la pelle, con cinque punti di sutura 3-0 ^5.
11. Standard post-operatorie procedure di recupero devono essere seguite con relative ispezioni al giorno per deiscenza o formazione di pus e amministrazione analgesico, se necessario.

5. Risultati rappresentativi

I film che si ottengono sono aumentati luminoso a colori, fini e hanno una superficie liscia (Figura 1). Sono anche flessibile e può essere arrotolato in tubi di piccolo diametro senza lacrime causano o altri danni evidenti (Figura 1B). L'adesivo rosa ha due picchi di assorbimento a 530 e 562 nm, il laser verde è pertanto fortemente assorbita dal collante e la lunghezza corrispondente attenuazione a 532 nm è ~ 12 um (Figura 3). In contrasto, chitosano film senza RB attenua debolmente il laser (1 / a ~ 162 micron), probabilmente dovuta alla dispersione. Risulta dalla trama spettri che nessuna aggregazione significativa di RB si verifica nei film.

La rosa adesivo si lega saldamentel'intestino upon irradiazione laser (Figura 2) realizzare un tipico carico massimo a rottura di 0,9 ± 0,4 N (n = 30). La forza adesiva è stato stimato come il carico massimo diviso per l'area della superficie adesiva, cioè, 15 ± 6 kPa (n = 30). Il non irradiato adesivo rosa legato significativamente inferiore al tessuto (2 ± 2 kPa, n = 30, t-test non appaiati p <10 ^6). In vivo anastomosi del nervo tibiale è stato raggiunto con successo dopo l'applicazione ed il legame dell'adesivo rose in combinazione con il laser verde. Una settimana dopo l'intervento, il nervo è stato operato in continuità e la forza di riparazione pari a 17 ± 9 kPa (n = 10).

Figura 1. A) L'RB-chitosano soluzione viene colata su una lastra piana Perspex (spessore soletta ~ 5 mm). Carta millimetrata è posto sotto la lastra di facilitare l'asciutto-cast passo. L'insolubile in acqua film è ottenuta due settimane dopo la fusione. B) L'adesivo rosa è flessibile e può essere arrotolato in un piccolo cilindro.

Figura 2. L'adesivo rosa è legato a intestino di vitello dopo irradiazione laser. Irraggiamento uniforme viene applicato l'adesivo durante RB tessuto-bonding; tuttavia spot selezionati sono mostrati in figura per illustrare l'effetto fotometabolismo del laser sull'adesivo.

Figura 3. Lo spettro di assorbimento (in unità arbitrarie) dell'adesivo rosa mostra due picchi a 530 e 562 nm. Il laser verde (λ = 532 nm) è quindi fortemente assorbita dall'adesivo durante l'esposizione laser. L'adesivo chitosano senza RB assorbe poco il raggio laser.

	n	(mm 2)	Potenza (W)	Tempo (s)	Fluence (J / cm 2)	I (W / cm 2)	Carico massimo / Area (kPa)
Adesivo + Laser	30	60 ± 10	0,18 ± 0,03	365 ± 5	~ 110	~ 0,9	15 ± 1
Adesivo	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

Tabella 1. Legend. n, numero del campione, Area, superficie dell'adesivo rosa (media ± errore massimo), Power, potenza del laser (media ± errore massimo), Tempo, tempo di irradiazione (media ± errore massimo), Fluence, fluenza laser media, io, stimato irradiance; Carico massimo / area, carico massimo a rottura del tessuto riparato divisa per la superficie adesiva, (media ± SE).

Discussione

La rosa fabbricazione adesivo è basato su un semplice processo a secco-cast, sebbene la dissoluzione di RB a pH acido richiede prolungata agitazione della soluzione di chitosano. È importante lasciare asciugare la soluzione fino a diventare una pellicola insolubile in acqua. Ciò avviene quando il contenuto di acqua peso ~ 10% nel film secco ^6. Pellicole insolubili vengono solitamente ottenuti 2 settimane dopo secco colata in condizioni standard di temperatura e pressione (~ 25 ° C e 1 atm ~). Il meccanismo di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Rosa Bengala	Sigma-Aldrich	632-69-9
Chitosano (MW medio)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Acido acetico glaciale	Sigma-Aldrich	08050051	2% v / v in acqua DI
Agitatore magnetico	Heidolph	MR Hei-Mix S
Centrifuga	Beckman Coulter	Allegra X-12R
Spettrofotometro	Varian	Cary 4000 UV-Visibile
Laser	CNI laser	MGL-532
Micrometro	Mitutoyo	Serie 227
Microscopio chirurgico	Zeiss	OPMI