Flusso di fluido interstiziale è elevata in tumori solidi e in grado di modulare l'invasione delle cellule tumorali. Qui si descrive una tecnica per applicare il flusso di fluido interstiziale alle cellule incorporati in una matrice e quindi misurare i suoi effetti sulla invasione cellulare. Questa tecnica può essere facilmente adattato per studiare altri sistemi.
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Articolo metodologico
Tridimensionale Cultura modello cellulare per misurare gli effetti del flusso del fluido interstiziale sulla Invasion cellule tumorali
In questo articolo
Sommario
Abstract
La crescita e la progressione della maggior parte dei tumori solidi dipendono dalla trasformazione iniziale delle cellule tumorali e la loro risposta a stroma segnalazione associata nel microambiente tumorale 1. In precedenza, la ricerca sul microambiente tumorale si è concentrata principalmente sui tumori stromali interazioni 1-2. Tuttavia, il microambiente tumorale include anche una varietà di forze biofisiche, i cui effetti sono scarsamente compreso. Queste forze sono le conseguenze biomeccaniche della crescita tumorale che portano a cambiamenti nell'espressione genica, la divisione cellulare, la differenziazione e l'invasione 3. Densità Matrix 4, rigidità 5-6, 6-7 e la struttura, la pressione del fluido interstiziale 8, e il flusso di fluido interstiziale 8 sono modificati durante la progressione del cancro.
Flusso di fluido interstiziale in particolare è maggiore nei tumori rispetto ai normali tessuti 8-10. La stima fl liquido interstizialevelocità ow stati misurato e trovato essere nell'intervallo di 0,1-3 um s -1, a seconda delle dimensioni del tumore e differenziazione 9, 11. Ciò è dovuto alla elevata pressione del fluido interstiziale causata da angiogenesi indotta da tumore e aumento della permeabilità vascolare 12. Flusso di fluido interstiziale ha dimostrato di aumentare l'invasione delle cellule tumorali 13-14 vascolari, fibroblasti e cellule muscolari lisce 15. Questa invasione può essere dovuto a gradienti chemiotattici autologhe create attorno cellule in 3-D 16 o maggiore di metalloproteinasi di matrice (MMP) espressione 15, secrezione di chemochine e l'adesione delle cellule espressione molecola di 17. Tuttavia, il meccanismo con cui le cellule rilevare il flusso di fluido non è ben compreso. Oltre a modificare il comportamento delle cellule tumorali, flusso di fluido interstiziale modula l'attività di altre cellule nel microambiente tumorale. E 'associato con (a) differenziazione dei fibroblasti di guida in tumore di promozione dei myofibroblasts 18, (b) trasporto di antigeni e di altri fattori solubili ai linfonodi 19, e (c) modulante morfogenesi delle cellule endoteliali linfatico 20.
La tecnica qui presentata impone flusso di liquido interstiziale su cellule in vitro e quantifica suoi effetti sulla invasione (Figura 1). Questo metodo è stato pubblicato in diversi studi per misurare gli effetti del flusso di fluido sulla stromali e invasione cellulare del cancro 13-15, 17. Variando la composizione della matrice, tipo di cellula, e la concentrazione cellulare, questo metodo può essere applicato ad altre malattie e sistemi fisiologici per studiare gli effetti del flusso interstiziale processi cellulari come l'invasione, la differenziazione, proliferazione, e l'espressione genica.
Protocollo
1. Assay Set-up
- Scongelare una piccola aliquota (<500 pl) di Matrigel in ghiaccio a 4 ° C (circa 2 ore).
- Preparare la ricetta gel (veda che i volumi di esempio nella tabella sottostante): 10x PBS (1x in volume totale), idrossido di sodio 1N (equivalente a 0.023 volumi di collagene aggiunta, o le raccomandazioni del costruttore del collagene, se del caso), Matrigel e collagene di tipo I a concentrazione finale di 1 mg / ml e 1,3 mg / ml, rispettivamente (formulazioni di matrice possono essere utilizzati altri a seconda del tipo di cellula e esperimento).
Esempio di gel ricetta
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Discussione
Qui abbiamo descritto un metodo per quantificare l'effetto del flusso interstiziale invasione delle cellule tumorali, utilizzando cellule annegate in una matrice 3-D in un inserto di coltura cellulare. Questi metodi e simili sono stati usati per studiare l'effetto del flusso interstiziale su una varietà di tipi cellulari 13-15, 17. Il nostro approccio imita parzialmente il microambiente matrice del tumore mediante collagene di tipo I e Matrigel che contengono proteine che si trovano nella membrana b.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Collagene (coda di topo) | BD | 354236 | Tenere sterile |
| Millicell cellule inserto cultura | Millipore | PI8P01250 | 8 diametro dei pori um, policarbonato membrana |
| Matrigel | BD | 354234 | Tenere sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x per la preparazione di soluzione di gel, 1x per i lavaggi |
| Idrossido di sodio, soluzione 1.0N | Sigma Aldrich | S2770 | Tenere sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Tenere sterile |
| Siero fetale bovino | Atlanta Biologicals | 511150 | Tenere sterile |
| Penicillina Streptomicina | Cellgro | 30002CI | Tenere sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0,5% in PBS |
| Paraformaldeide | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Acqua deionizzata | Tenere sterile | ||
| 4 ',6-diaminido-2-fenilindolo (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg / ml di soluzione concentrata |
| Soluzione di montaggio | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Tripsina-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Tenere sterile |
Riferimenti
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell....
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Ristampe e permessi
