Articolo metodologico

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell'attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

DOI:

10.3791/4168

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6 agosto 2012

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1Department of Pharmacology & Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh Cancer Institute, 3Department of Experimental Therapy, The Netherlands Cancer Institute, 4Department of Human Genetics, University of Pittsburgh School of Public Health

In questo articolo

Sommario

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Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari. Il test produce tassi di attività DNA Repair suscettibili di analisi cinetica ed è adattabile per la quantificazione delle attività di riparazione del DNA nei tessuti e lisati tumorali o con le proteine ​​purificate.

Abstract

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Noi descriviamo un metodo per la determinazione quantitativa, misurazione in tempo reale di DNA glicosilasi e attività di endonucleasi di AP in lisati cellulari nucleari di base utilizzando escissione riparazione (BER) segnali molecolari. Il substrato (beacon) è costituito da un deoxyoligonucleotide contenente una singola lesione base con un 6-carbossifluoresceina (6-FAM) porzione coniugata alla estremità 5 'e una frazione DABCYL coniugato all'estremità 3' dell'oligonucleotide. Il faro BER molecolare è 43 basi di lunghezza e la sequenza è progettato per favorire la formazione di una forcina struttura con 13 nucleotidi nel ciclo e 15 coppie di basi in 1,2 stelo. Quando ripiegato in questa configurazione il 6-FAM frazione viene bloccata mediante DABCYL in un modo non fluorescente tramite trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) 3,4. La lesione è posizionato in modo tale che in seguito alla rimozione lesione base e scissione filamento il restante 5 oligonucleotide base contenente il 6-FAM frazione viene rilasciato dallo stelo. Rilasciare undistacco dalle nd (DABCYL) risultati quencher in un aumento di fluorescenza che è proporzionale al livello di riparazione del DNA. Con la raccolta di più letture dei valori di fluorescenza, valutazione in tempo reale dell'attività BER è possibile. L'impiego di standard quantitativa PCR in tempo reale strumenti consente l'analisi simultanea di numerosi campioni. La progettazione di questi fari BER molecolari, con una lesione singola base, è suscettibile di analisi cinetica, la quantificazione BER e convalida inibitore ed è adattabile per la quantificazione dell'attività riparazione del DNA in tessuto e lisati cellulari tumorali o con proteine ​​purificate. L'analisi dell'attività BER in lisati tumorali o tessuto aspira utilizzando questi segnali molecolari può essere applicabile a misurazioni biomarker funzionali. Inoltre, l'analisi dell'attività BER con proteine ​​purificate utilizzando questo saggio quantitativo fornisce una rapida, ad alta capacità metodo per la scoperta e la convalida di inibitori BER.

Protocollo

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1. Beacon Progettazione Molecolare

1,1 Progettazione e ordinare il vostro segnale molecolare

Il design del faro molecolare deve considerare quanto segue:

  1. Abbiamo buoni risultati con il 43-mer oligonucleotidi di DNA. Il contenuto di GC deve essere> 32%. Escludere una base di G al 5 '.
  2. Richiesta 6-FAM (6-carbossifluoresceina) coniugazione sulla estremità 5 'e DABCYL come 3' modifica.
  3. La posizione della lesione deve essere su base # 6 dal 5 '.
  4. La lunghezza dello stelo o duplex forcina dovrebbe essere un minimo di 15 bp.
  5. La lunghezza dell'anello consig....

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Discussione

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Ci sono più di 600 citazioni usando 'faro molecolare' il termine per rilevare e quantificare molecole di numerose attività enzimatiche, inclusa l'attività elicasi 6, attività di DNA polimerasi 7,8, l'attività del DNA ligasi 9, l'attività della telomerasi 10, l'attività del DNA fotoliasi 11 e DNA / RNA ibridi 12, tra molti altri. Oltre all'uso di segnali molecolari per la misurazione delle attività di riparazione del DNA sopra e.......

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Dichiarazioni

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RWS è un consulente scientifico per Trevigen, Inc. Il resto degli autori dichiarano che non ci siano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Pittsburgh e il National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] per RWS. Il supporto per lo strumento UPCI lentivirale è stata fornita RWS mediante la concessione di supporto Cancer Center dal National Institutes of Health [P30 CA047904]. Il sostegno è stato fornito anche dalla University of Pittsburgh Dipartimento di Farmacologia & Chemical Biology al DS. Il sostegno è stato fornito anche da ESTRO a CV.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo Comments
Cloruro di potassio Pescatore P217-500 Grade molecolare
EDTA Pescatore BP120-500
Glicerina Pescatore BP229-1 Grade molecolare
DTT Pescatore BP172-5
HEPES-Solution Invitrogen 15630
HEPES-Salt Sigma H4034-500G
Idrossido di potassio Sigma 17-8
0.22μM filtro Nalgene 167-0020
Slide-A-Lyzer dialisi Prodotti Perforare 66373 MW 7000
Siringa Pescatore 309659
Ago Pescatore 305196
Microcentrifuga 1,5 ml Tubes Pescatore 05-408-129 Nero
Falcon 15 ml Tubes Pescatore 352097
NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
PBS Invitrogen 14190
Molecular Beacons IDT
BioRad Protein test dye reagente di concentrato BioRad Cat # 500-0006

Riferimenti

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  1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
  2. Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor pote....

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Base Excision RepairMolecular Beacon AssayDNA Glycosylase ActivityAP Endonuclease ActivityReal time Fluorescence MeasurementQuantitative PCR AnalysisNuclear Lysate PreparationLesion specific DetectionFRET based QuantificationDNA Repair Kinetics

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