Articolo metodologico

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

DOI:

10.3791/4176

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16 novembre 2012

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1UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne, Université Lyon 1, Université de Lyon, 2Département Biosciences, INSA de Lyon, Université de Lyon, 3INSERM U758, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Université de Lyon, 4Laboratoire de Génie Civil et Ingénierie Environnementale, INSA de Lyon, Université de Lyon

In questo articolo

Sommario

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La progettazione di un operone codifica sintetico sia l'apparato secretorio ei monomeri di fibre strutturali curli è descritto. Sovrapproduzione di questi amiloidi e polimeri aderenti permette un guadagno misurabile di aderenza del E. coli Telaio 1. Un modo semplice per visualizzare e quantificare l'aderenza sono spiegato.

Abstract

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Il metodo qui descritto consiste nel ridisegnare E. aderenza proprietà coli assemblando il numero minimo di curli geni sotto il controllo di un promotore forte e metallo-overinducible, e nella visualizzazione e quantificare il guadagno risultante di adesione batterica. Questo metodo si applica principi di ingegneria appropriati di astrazione e la normalizzazione della biologia sintetica, e risultati in Biobrick BBa_K540000 (Miglior dispositivo Biobrick nuovo, progettato, iGEM 2011).

La prima fase consiste nella progettazione dell'operone sintetico dedicato sovrapproduzione curli in risposta al metallo, e quindi ad aumentare le capacità di aderenza del ceppo di tipo selvatico. L'originale curli operone è stato modificato in silico al fine di ottimizzare i segnali trascrizionali e traslazionali e sfuggire alla regolazione "naturale" di curli. Questo approccio ha permesso di testare con successo la nostra attuale comprensione della produzione curli. Moreover, semplificando la regolazione curli commutando il promotore endogeno complesso (più di 10 regolatori trascrizionali identificati) per un semplice metallo promotore regolato rende aderenza molto più facile da controllare.

La seconda fase prevede la valutazione qualitativa e quantitativa delle capacità di adesione mediante applicazione di metodi semplici. Questi metodi sono applicabili ad una vasta gamma di batteri aderenti indipendentemente strutture biologiche coinvolte nella formazione di biofilm. Prova di aderenza in piastre da 24 pozzetti in polistirene fornisce una visualizzazione rapida preliminare del biofilm batterico dopo colorazione violetto cristallo. Questo test qualitativo può essere affilata per la quantificazione della percentuale di adesione. Tale metodo è molto semplice ma più accurato solo colorazione viola cristallo come descritto in precedenza con 1 sia una buona ripetibilità e riproducibilità. Visualizzazione di batteri GFP-tagged su vetrini con la fluorescenza o conf lasermicroscopia Ocal permette di rafforzare i risultati ottenuti con il 24 pozzetti piastra prova mediante osservazione diretta del fenomeno.

Introduzione

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L'adesione batterica al supporto abiotico svolge un ruolo importante nelle celle a combustibile biorisanamento, biocatalisi o microbica. Processi di biorisanamento utilizzare le capacità dei microrganismi di degradare sostanze organiche, o per modificare la distribuzione del metallo (immobilizzazione, volatilizzazione) o speciazione. Queste attività benefiche sono osservati negli ecosistemi acquatici e terrestri, ma anche nei sistemi artificiali sviluppati per il trattamento di acque inquinate di rifiuti industriali e domestici. L'intensità e la qualità dell'attività microbica dipendono fattori fisico-chimici, ma anche sullo stile di vita dei microrganismi (free-floating o incorporato in biofilm). La formazione di biofilm è associato un metabolismo promuovere resistenza ai biocidi da meccanismi diversi. Questo fenomeno sarà dunque incoraggiata maggior parte dei processi di biorisanamento. Inoltre, ingegneria cellule di Escherichia coli per controllare la formazione di biofilm è stato applicato con successoimmobilizzare cellule intere sensori su biochip 2-3.

Adattamento dei microrganismi a concentrazione di metalli avviene attraverso diversi meccanismi quali adsorbimento a componenti della matrice extracellulare, attivazione della pompa di efflusso o di vettori specifici in grado di concentrare il metallo nella cella. Incrementare queste attività batteriche tramite ingegneria genetica consente trattamento efficiente ed economico di inquinamento da metalli in scala di laboratorio, in particolare nel caso di metalli altamente tossici in quantità debole come descritto da Raghu et al. 2008 4. Bonifica batterica rappresenta in questo caso un metodo di risparmio e costo competitivo rispetto ai processi chimici classici con resine a scambio ionico. Gli autori hanno descritto un E. telaio coli geneticamente modificati per l'assorbimento e la ritenzione cobalto prima battendo l'efflusso pompa gene che codifica rcnA, e poi la trasformazione con una copia più plasmide sovrapproduzione permettendo di untrasportatore con captazione preferenziale per il cobalto. Tale ceppo appare come una valida alternativa alle resine a scambio ionico per il trattamento di effluenti radioattivi, ma una questione chiave irrisolta è il recupero di batteri contaminate al termine del processo 4. L'obiettivo del nostro lavoro è stato quindi di progettare una custom-designed ceppo in grado di attenersi ai supporti abiotici quali il vetro o plastica.

Tra l'insieme delle adesine e fimbrie aderente identificati batteri Gram-, abbiamo scelto di progettare un sistema che consenta di produzione curli. Curli sono fibre amiloidi sottili (2-5 nm di diametro) e altamente aggregativa che sporgono dalla E. coli e Salmonella superficie come matrice non cristallino e insolubile 5-7. Curli sono anche coinvolti nella colonizzazione delle superfici abiotiche e lo sviluppo di biofilm 8. Curli sono stati recentemente dimostrato di legare ioni di mercurio 9. Amiloidi sono infatti noti per possedere elevataaffinità per ioni di metalli come Cu 2 +, Zn 2 + e Fe 3 + 10. Questa proprietà potrebbe migliorare ulteriormente la decontaminazione di metallo effluenti inquinati. Il cluster CSG è responsabile per la produzione di fibre curli ed è costituito da due operoni trascritti divergentemente (Figura 1). L', CSGB csgA e geni csgC costituiscono l'operone senso, codifica le due subunità curli, CsgA e CSGB. CsgC sembra essere coinvolto in attività redox all'interno del sistema biogenesi curli e di influenzare il comportamento dei pori CsgG 11. Tuttavia, l'assenza di csgC nella maggior parte dei batteri produttori curli indica che la proteina corrispondente fornisce solo un livello secondario di controllo sulla biogenesi curli. Per semplificare il sistema, abbiamo scelto di lavorare con il minimo numero di geni.

Il csgDEFG operonencodes proteine ​​essenziali nella regolazione e trasportodi CsgA e CSGB alla superficie cellulare. CsgD è un attivatore trascrizionale dell'operone csgBAC e svolge un ruolo chiave nel controllo della formazione di biofilm controllando la produzione delle fimbrie curli e altri componenti biofilm come cellulosa 12 e inibendo la produzione flagellum 13. CsgE, CsgF e CsgG costituiscono una curli-specifico apparato secretorio nella membrana esterna attraverso cui viene secreto principali curli subunità proteica CsgA come proteina solubile. La polimerizzazione di CsgA dipende in vivo sulla membrana legata nucleator proteina CSGB (recensione in 14). Complessi percorsi regolatori coinvolgono diversi sistemi a due componenti hanno dimostrato di controllare l'espressione del gene curli 15-16. Questi regolamenti complessi permettere ai batteri di formare biofilm di spessore attraverso la produzione curli in risposta a stimoli ambientali, ma sono difficili da controllare per applicazioni industriali. Per facilitare il recupero della metal-farcito batteri durante un processo industriale, fissazione batterica ad un supporto solido deve effettivamente essere controllato dal parametro ben definito (s). Le proprietà di aderenza di curli sono legati alla loro natura amiloide 17 e potrebbe essere utilizzata per migliorare i processi di biorisanamento, ma un dispositivo semplice e facilmente controllato deve essere creato.

Tra questi 7 geni 18, una serie di cinque geni assolutamente necessaria per curli sintesi (CSGB e csgA monomeri fibra codifica) e l'esportazione (csgE csgF e csgG, che codifica il complesso secrezione curli) sono stati selezionati per costruire l'operone sintetico. Per sfuggire alla regolazione "naturale" di curli, un operone sintetico composto da questi 5 geni CSG sotto il controllo di un promotore forte e cobalto-overinducible (Figura 2) è stato progettato e sintetizzato. Il passo-passo analisi della curli-regione codificante e la procedura di progettazione di un funzionale synsintetico dell'operone sono descritti. Due metodi per visualizzare e quantificare l'adesione batterica al polistirolo e vetro sono spiegato.

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Protocollo

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1. Biobrick Progettazione e Sintesi del Operon curli

  1. Determinare l'organizzazione genetica e localizzare i segnali endogeni trascrizionale e traduzionale dei geni curli. Queste informazioni sono raccolte in banche dati specializzate come RegulonDB a o b EcoGene e completato da una lettura attenta delle pubblicazioni pertinenti. Gestione dei dati e in silico preanalysis sono state effettuate con il software c Clone Manager.
  2. Selezionare le sequenze codificanti pertinenti. Un insieme di cinque geni assolutamente necessari per curli sintesi (CSGB e csgA monomeri fibra di codifica) e l'esportazione (csgE csgF e csgG, che codifica il complesso secrezione Curlin) sono stati selezionati per costruire l'operone sintetico. Estrarre le sequenze scelte dalla base dati in formato FASTA.
    Come cluster csgGFE è antisenso in E. coli genoma, convertire questa sequenza nel suo counterp complemento inversoarte utilizzando gli strumenti di Gestione dei Cloni Operations> molecola di processo> Inverti molecola. Incollare la sequenza csgEFG dietro csgBA utilizzando la funzione di "legare" (Clone> legare).
  3. Aggiungere il promotore appropriato. Ponendo le cinque geni selezionati curli sotto il controllo del promotore RCN P, curli si prevede essere sovra-prodotta in presenza di cobalto e nichel. Il locus RCN codifica una pompa di efflusso responsabile per la disintossicazione Ni e Co (rcnA) e la sua affine metallo-regolatore (rcnR). RcnR controlla l'espressione del gene e la sua rcnA proprio in risposta a Ni e Co 19. La sequenza RCN comprendente CDS rcnR, l'intera regione intergenica RCN più i 41 nucleotidi del primo rcnA era placedin anteriore della sequenza csgBAEFG chimerica (figura 1, la sequenza del intero costrutto viene fornito come dati supplementari).
  4. Ottimizzare la trascrizionalesegnali. Un perfetto sito di legame ribosomiale (o perfetta RBS = AAGGAGGTATATA) è stato aggiunto davanti al primo ATG della sequenza di DNA csgBA. Un secondo RBS perfetto stato aggiunto davanti alla sequenza csgEFG. RBS endogena per la CSGB e geni csgF e csgG sono stati conservati.
  5. Per il montaggio standard iGEM, il dispositivo deve essere affiancato da un prefisso standard BioBrick e suffisso, contenenti siti di restrizione per Eco RI, Pst I (prefisso) e Spe I e Xba I (suffisso). Incollare le sequenze corrispondenti a ciascuna estremità del dispositivo d.
  6. Eliminare eventuali Eco RI, Pst I, Spe I e Xba sito di riconoscimento ho nel dispositivo. Per facilitare il processo di ulteriore montaggio, la parte BioBrick stessa non può contenere uno di questi siti di restrizione. In analisi di restrizione in silico del dispositivo rivelato un Pst I sito nella sequenza csgA, un Pst sito che ho nella sequenza rcnRe un sito Eco RI nel gene csgE. Questi siti sono rispettivamente situati in posizione 80 (Mut1), 1340 (Mut2) e 1830 (Mut3) della sequenza dispositivo (dati complementari) e sono stati modificati come segue da mutazioni silenti.
    Mut1 Pst sito ho CTGCAG cambiato CGTCTG
    Mut2 Pst sito ho CTGCAG cambiato CAGCAG
    Mut3 Eco sito GAATTC RI cambiato GAATT
  7. Corri attraverso la simulazione di traduzione utilizzando il software di gestione Clone (Funzionamento> molecole di processo> molecole Translate). Utilizzare l'allineamento BLAST sequenza di programma per verificare la perfetta omologia tra la proteina wild type curli e le proteine ​​codificate dal operone sintetico.
  8. Ordinare il operone sintetico. Servizi commerciali di sintesi del gene sono disponibili presso numerose aziende di tutto il mondo, il nostro partner è stato Genecust (Lussemburgo). 4 microgrammi dell'operone artificiale (3165 bp) sono stati ricevuti qualche settimana dopo e inserite in pUC57 (pIG2).

2. Visualizzare e quantificare i batteri aderenti sul polistirolo

  1. Riempire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in polistirene con 2 ml di terreno minimo M63 (glucosio 0,2%) e inoculare ogni pozzetto con 106 cellule di una coltura durante la notte. Crescere i batteri a 30 ° C per 18-48 ore senza agitare. Ogni colonna (4 pozzetti) rappresenta una modalità. Aggiungere la giusta quantità di cobalto (25 a 100 mm) e antibiotici (ampicillina 100 μg.L -1) quando necessario. Le prime tre righe della 24-pozzetti vengono utilizzati per quantificare i batteri aderenti facendo la media delle tre ripetizioni, l'ultima fila di sinistra è utilizzato per visualizzare il biofilm.
  2. Per le 3 prime file a 24 pozzetti: per ogni bene, recuperare il surnatante contenente le cellule planctoniche.
  3. Sciacquare accuratamente ogni pozzetto con 1 ml di M63 e la piscina il 1 lavaggio ml con il supernatante iniziale ottenuto in 2.2). Questa piscina è denominato cellule nuoto (= S).
  4. Recuperare il biofilm in 1 ml of M63 raschiando e pipettando su e giù (= B). Vortex 15 sec. Stimare il numero di batteri in superficie allegate e bagno alla densità ottica a 600 nm (OD600) per dare la percentuale aderenza corrispondente a ciascuna modalità.
  5. La percentuale di adesione è calcolata utilizzando la formula: BX100 / (3xs + B).
  6. Solo per l'ultima riga dei 24 pozzetti: eliminare le cellule planctoniche.
  7. Risciacquo con 1 ml di M63 del biofilm che aveva sviluppato sul fondo della piastra.
  8. Essiccare la piastra aperta per 1 ora a 80 ° C.
  9. Aggiungere 100 ml di cristalvioletto 20% per 2 min in ciascun pozzetto seguito da lavaggi con acqua estese per visualizzare le superficie-attached batteri.
    Tre saggi indipendenti (piastre) devono essere eseguite per garantire la riproducibilità.

3. Visualizza batteri aderenti su vetro di Microscopia

  1. Prendi un telaio fluorescente. La E. coli SCC1 ceppo e che constitutively esprime la proteina fluorescente verde (GFP), con nessuna differenza osservabile dal ceppo MG1655 20 è un ospite adatto per il cuscinetto plasmide sintetico curli operone.
  2. Trasformare SCC1 con il plasmide pIG2 (= sintetico curli operone inserita alla Eco RI / Pst I sito del plasmide pUC57) per ottenere il ceppo S23. Trasformare SCC1 con un plasmide di controllo (pUC18) per ottenere il ceppo di controllo S24 21.
  3. Crescere precultures overnight della S23 e del controllo (S24) ceppi a 30 ° C in terreno M63 integrato con glucosio (0,2%) e ampicillina (100 μg.L -1).
  4. Inoculare 15 ml dello stesso terreno in piastre di Petri con 100 microlitri della precultures. Aggiungere la giusta concentrazione di cobalto (cioè 25 pM) e non dimenticare il controllo negativo senza cobalto. Introdurre 3 coprioggetto rettangolare in vetro in ogni piastra di Petri. Incubare per una notte a 30 ° C senza agitazione.
  5. Rimuovere il coprioggetto from la piastra di Petri e con attenzione lo scarico. Pulire accuratamente la faccia inferiore con una roba di cotone piccolo impregnato con etanolo al 70 ° con l'annientamento di sconto su ogni residuo batterica. Per l'osservazione confocale, pulire entrambe le estremità superiori di qualche millimetro per consentire la fissazione ulteriore coprioggetto.
  6. Batteri aderenti possono essere visualizzati direttamente ma rapidamente sotto microscopio a fluorescenza, ma accuratamente evitare l'essiccazione del campione.
  7. Per l'osservazione confocale, depositare il coprioggetto su un vetrino di vetro con la faccia superiore ricoperta dal biofilm disposta a faccia. Il biofilm viene poi coperto con un vetrino coprioggetto più grande, che è fissato al vetrino con vernice. Invertire l'impostazione in modo che il biofilm sarà ora sulla faccia inferiore.
  8. Posizionare la configurazione al microscopio laser confocale. Un diritto Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscopio laser confocale è stato utilizzato al f piattaforma Platim.
  9. Impostazione. GFP Excite a 488 nm, e raccogliere la fluorescenza batterica nell'intervallo 500-600 nm . Utilizzare 40x obiettivo ad immersione in olio per l'acquisizione di immagini in modalità a scansione laser confocale. Scansionare i complessivi strutture tridimensionali dei biofilm dalla superficie solida per l'interfaccia con il mezzo di crescita, utilizzando un passo di 1 um.
  10. Eseguire proiezioni tridimensionali con Imaris software (Bitplane, Zurigo, Svizzera). Determinare lo spessore del biofilm dall'analisi del valore medio z lungo statistici sezioni longitudinali. Quantificazione di biovolumes biofilm può essere estratto da confocale z-stacks come descritto altrove 22.

un RegulonDB fornisce informazioni sui meccanismi sull'organizzazione dell'operone e la loro scomposizione in unità di trascrizione, promotori e il loro tipo sigma, geni e dei loro siti di legame ribosomiale, terminatori, siti di legame di specifici regolatori trascrizionali, così come la loro organizzazione in frasi di regolamentazione.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

b Il database EcoGene contiene informazioni aggiornate sulla E. coli K-12 sequenze del genoma e proteoma, tra cui ampie bibliografie gene. Un obiettivo EcoGene importante è stata la rivalutazione dei siti di inizio di traduzione. http://ecogene.org/

c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

Dono e di Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, Singapore.

f Platim microscopica piattaforma UMS3444 BioSciences Gerland - Lione Sud.

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Risultati

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In annotazione silico della sequenza selvatico CSG tipo di E. coli K12 associato con l'ottimizzazione dei segnali trascrizionale e traduzionale ha permesso di progettare il singolo sintetico curli operone P RCN-csg mostrato in Figura 3 (sequenza completa in dati supplementari). Protocollo 2 e del protocollo 3 sono stati utilizzati per visualizzare e quantificare l'aderenza associato alla produzione curli. Usando colorazione viola cristallo su piastre da 24 po...

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Discussione

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Passaggi critici

La fase più critica in questo approccio biologia sintetica è la progettazione gene. Disegno gene sintetico deve essere meticolosa per garantire un sistema di produzione efficiente. Due geni codificanti i monomeri fibra e tre geni codificanti per proteine ​​coinvolte nel loro sistema di secrezione sono stati montati con un promotore forte e metallo-inducibile per creare una nuova unità funzionale per una nuova applicazione: il bio-decontaminazione di effluente nucleare. Come pre...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Ringraziamo gli altri membri della squadra di INSA-ENS iGEM Lione (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Ly Goki, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon e Valérie Desjardin), i nostri sponsor per il loro sostegno finanziario (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lione e il Dipartimento di Bioscienze INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé per la lettura critica di questo manoscritto e il dottor Sze CC per il regalo ceppo. Drogue B. riceve un dottorato di ricerca borsa di studio Région Rhône-Alpes.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
pIG2 pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) con un bp 3165 EcoRI / PstI frammento contenente il sintetico P RCN - csgBAEFG operone; Amp r
pUC18 Multicopia plasmide (pMB1 ori, 2686 bp), Amp r
S23 SSC1 (= GFP-tagged MG1655, dono di CC Sze) / pIG2
S24 SSC1/pUC18
CoCl 2 Sigma 0,1 M soluzione madre conservato a temperatura ambiente
M63 29
24-pozzetti Nunc 55429 Polistirene piastre da 24 pozzetti

Riferimenti

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