Compact Quantum Dots per singola molecola Imaging

Summary

Si descrive la preparazione di punti quantici colloidali con minimizzata dimensione idrodinamica per singola molecola imaging di fluorescenza. Rispetto ai tradizionali punti quantici, queste nanoparticelle sono di dimensioni simili alle proteine ​​globulari e sono ottimizzati per singola molecola luminosità, stabilità contro la fotodegradazione, e resistenza al legame non specifico a proteine ​​e cellule.

Abstract

Singola molecola di imaging è uno strumento importante per la comprensione dei meccanismi di funzionamento biomolecolare e per visualizzare l'eterogeneità spaziale e temporale dei comportamenti molecolari che sono alla base della biologia cellulare ^1-4. Esporre una singola molecola di interesse, è tipicamente coniugato ad un tag fluorescente (colorante, proteine, perlina, o quantum dot) e osservato con epifluorescenza o totale riflessione interna fluorescenza (TIRF) microscopio. Mentre coloranti e proteine ​​fluorescenti sono state il pilastro di immagini a fluorescenza per decenni, la loro fluorescenza è instabile in alto fondenti fotoni necessari per osservare singole molecole, ottenendo solo pochi secondi di osservazione prima completa perdita di segnale. Perle di lattice e perline dye-etichettati fornire stabilità del segnale migliorata, ma a scapito della dimensione idrodinamica drasticamente più grande, che può alterare deleteria la diffusione e il comportamento della molecola in esame. S copi "> Punti quantici (QD) offrono un equilibrio tra questi due regimi problematici. Queste nanoparticelle sono composti da materiali semiconduttori e può essere costruito con un idrodinamico compatto con eccezionale resistenza alla fotodegradazione ^5. Così, nel corso degli ultimi anni QD sono state fondamentali per consentire osservazione a lungo termine del comportamento complesso macromolecolare a livello di singola molecola. Tuttavia, queste particelle sono ancora stati trovati esporre diffusione ridotta in ambienti affollati molecolari come il citoplasma cellulare e la fessura sinaptica neuronale, in cui le loro dimensioni sono ancora troppo grandi ^{4,6 , 7.}

Recentemente abbiamo progettato i nuclei e rivestimenti per superfici di QD per ridurre al minimo dimensioni idrodinamico, mentre il bilanciamento offset per la stabilità colloidale, fotostabilità, luminosità, e vincolante non specifici che hanno impedito l'utilità di QD compatti in passato ^8,9. L'obiettivo di questo articolo è quello di dimostrarela sintesi, la modifica e la caratterizzazione di questi nanocristalli ottimizzate, composto da una lega Hg Cd _{x 1-x} Se nucleo rivestito con un isolante Zn Cd _{y 1-y} shell S, ulteriormente rivestito con un legante polimerico multidentati modificato con polietilenglicole corta ( PEG) catene (Figura 1). Rispetto ai nanocristalli CdSe convenzionali, Hg Cd _{x 1-x} leghe selenio offrire maggiori rese quantiche di fluorescenza, fluorescenza a lunghezze d'onda rosse e nel vicino infrarosso per una maggiore rapporto segnale-rumore nelle cellule, e di eccitazione a lunghezze d'onda visibili non citotossiche. Multidentati rivestimenti polimerici legarsi alla superficie nanocristallo in una conformazione chiusa e piana di minimizzare la dimensione idrodinamica, PEG e neutralizza la carica superficiale per ridurre il legame non specifico di cellule e biomolecole. Il risultato finale è un nanocristallo brillantemente fluorescente con emissione tra 550-800 nm e una dimensione idrodinamica totale vicino a 12 nm. Questo è in same gamma di dimensioni, come molte proteine ​​globulari solubili nelle cellule, e di dimensioni notevolmente inferiori rispetto ai tradizionali QD pegilato (25-35 nm).

Protocol

Le procedure di sintesi seguenti comporta standard di aria libere tecniche e l'uso di un vuoto / collettore gas inerte; metodologia dettagliata può essere trovata in riferimenti 10 e 11. Scheda di sicurezza per tutte le sostanze potenzialmente tossiche e infiammabili deve essere consultata prima dell'uso e composti tutti infiammabili e / o aria-labile deve essere frazionato in setto-fiale sigillate in un vano portaoggetti o borsa guanto.

1. Sintesi di seleniuro di cadmio mercurio (Hg Cd _{x 1-x} Se) Quantum Dot Nuclei

1. Preparare una soluzione 0,4 M di selenio in trioctylphosphine (TOP). Aggiungere selenio (0,316 ....

Results

La figura 2 mostra l'assorbimento di rappresentanza e spettri di fluorescenza per nanocristalli CdSe Hg, Cd _{x 1-x} nanocristalli di Se dopo di scambio cationico, Hg e Cd _{x 1-x} Se / Zn Cd _{y 1-y} S nanocristalli dopo la crescita della conchiglia. I nanocristalli CdSe nucleo ha una resa quantica di fluorescenza vicino a 15% (compreso lunghezza d'onda di emissione deep-trap) ma questa efficienza scende a meno di 1% dopo mercurio scambio, probabilmente a causa di addebitare tra.......

Discussion

Rispetto ai tradizionali CdSe punti quantici, in lega ternaria Hg Cd _{x 1-x} nanocristalli SE può essere sintonizzato per dimensioni e lunghezza d'onda di fluorescenza in modo indipendente. La dimensione viene prima selezionata durante la sintesi di nanocristalli CdSe nuclei, e la lunghezza d'onda di fluorescenza viene scelto in una fase secondaria di scambio cationico mercurio, che non alteri sostanzialmente le dimensioni nanocristallo ^9. È importante permettere purificato Hg Cd _{x 1-x}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Selenio	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octylphosphine	Strem	15-6655	97% puro, instabile in aria
Ossido di cadmio	Sigma-Aldrich	202894	Altamente tossico: l'uso cautela
Tetradecylphosphonic acido	PCI Sintesi	4671-75-4
Octadecene	Alfa Aesar	L11004	Grado tecnico
Esadecilammina	Sigma-Aldrich	H7408
Diphenylphosphine	Sigma-Aldrich	252964
Mercurio acetato	Sigma-Aldrich	456012	Altamente tossico: l'uso cautela
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Forte odore
Acido oleico	Sigma-Aldrich	W281506
Zinco acetato	Alfa Aesar	35792
Cadmio acetato idrato	Sigma-Aldrich	229490	Altamente tossico: l'uso cautela
Oleilammina	Fisher Scientific	AC12954	Instabile in aria
Zolfo	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine ossido	Strem	15-6661	99%
Piridina	VWR	EM-PX2012-6	Anidro
Tioglicerolo	Sigma-Aldrich	M1753	Forte odore
Trietilammina	Sigma-Aldrich	471283	Anidro
Dialisi tubo	Spectrum Labs	131342	20 kDa cutoff
Filtro centrifugo	Millipore	UFC801024	10 kDa di taglio
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-dimetossi-1 ,3,5-triazin-2-il)-4-idrato methylmorpholinium cloruro	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Più Sistema per cromatografia	GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL cromatografia su colonna	GE Healthcare	17-5172-01
Agarosio, OmniPur	VWR	EM-2120
			Appendice Sintesi di mercurio octanethiolate: Aggiungere lentamente una soluzione di acetato di mercurio metanolo (1 eq.) Ad una soluzione sotto agitazione di 1-octanethiol (3 eq.) E idrossido di potassio (3 eq.) In metanolo a temperatura ambiente. Isolare il (II) octanethiolate mercurio precipitato mediante filtrazione, lavaggio due volte con metanolo e una volta con etere, e quindi asciugare sotto vuoto. Sintesi di multidentati polimero: Sciogliere acido poliacrilico (1 g, 1.773 Da) in 25 ml di dimetilformammide (DMF) in 150 ml pallone a tre colli e bolle con argon per 30 minuti. Aggiungere una soluzione anidra di cisteamina (374 mg, 4,87 mmol) in 10 ml di DMF. A temperatura ambiente sotto vigorosa agitazione, aggiungere lentamente diisopropilcarbodiimmide anidro (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) in 30 min, seguito da trietilammina (170 pl, 1,22 mmol), e consentire la reazione per 72 ore a 60 ° C. Aggiungi mercaptoetanolo (501 mg, 6,41 mmol) per spegnere la reazione, e mescolare per 2 ore a temperatura ambiente. Rimuovere DMF tramite evaporazione rotante ed isolare il polimero con l'aggiunta di una miscela 2:1 di acetone ghiacciato: cloroformio, seguito da centrifugazione. Sciogliere il polimero in ~ 5 ml di DMF anidra, filtro, nuovamente precipitato con etere dietilico, e ripetere. Asciugare il prodotto sotto vuoto e conservare sotto argon. Determinazione del diametro del nucleo CdSe: Dal UV-Vis spettro di assorbimento determinare la lunghezza d'onda del primo eccitone picco (λ, in nm), che è la più lunga lunghezza d'onda di picco (ad esempio circa 498 nm per CdSe in figura 2a), e utilizzare il dimensionamento curva di Mulvaney e collaboratori 12: Determinazione della concentrazione CdSe nanocristalli: Da un background-sottratto UV-Vis spettro di una soluzione otticamente trasparente di nanocristalli CdSe, determinare l'assorbimento a 350 nm. Diluizioni seriali possono essere utilizzati per determinare se l'assorbimento ottico è entro l'intervallo lineare di legge di Beer. La concentrazione nanocristallo (QD, in M) può essere determinata inserendo il diametro nanocristallo (D, in nm), il valore di assorbimento ottico (A 3SA), e la lunghezza del percorso cuvetta (l, in cm) nell'equazione seguente la correlazione empirica di Bawendi e collaboratori 13: