Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

Sommario

Il metodo proposto offre un modo per rilevare funzionali autoanticorpi cardiotropic efficaci nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa, indipendentemente l'antigene specifico, analizzando l'impatto di immunoglobulina paziente isolato su accorciamento cellulare e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti isolati di ratto.

Abstract

Cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle principali cause di insufficienza cardiaca nei giovani adulti ^1. Sebbene predisposizione genetica ed esposizione a sostanze tossiche sono note cause per questa malattia in circa un terzo dei pazienti, l'origine di DCM rimane poco chiara. In un numero considerevole di questi pazienti, gli anticorpi contro epitopi cardiaci sono stati individuati e sono sospettati di svolgere un ruolo centrale nella insorgenza e la progressione della malattia ^2,3. L'importanza di autoanticorpi cardiache è sottolineata da un miglioramento emodinamico osservato nei pazienti DCM dopo l'eliminazione di autoanticorpi da immunoassorbimento ^3-5. Una varietà di antigeni specifici sono già stati individuati ^2,3 e anticorpi contro tali obiettivi possono essere rilevati da immunosaggi. Tuttavia, questi test non può discriminare tra stimolante (e quindi funzionalmente efficaci) e bloccando autoanticorpi. Vi è una crescente evidence che questa distinzione è cruciale ^6,7. Si può anche ritenere che gli obiettivi di un certo numero di anticorpi cardiotropic sono ancora da identificare e pertanto non può essere rilevato dal test immunologici. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per la rilevazione di anticorpi funzionalmente attivi cardiotropic, indipendentemente dal loro rispettivo antigene. Lo sfondo per il metodo è l'alta omologia di solito osservata per le regioni funzionali di proteine ​​cardiache nei mammiferi tra ^8,9. Questo suggerisce che gli anticorpi diretti contro antigeni cardiaci umani reazione crociata con non umani cellule bersaglio, che permette prove di IgG da pazienti DCM su cardiomiociti di ratto adulto. Il nostro metodo si compone di 3 fasi: la prima, IgG è isolato dal plasma del paziente con sefarosio accoppiati anti-IgG anticorpi ottenuti da colonne immunoassorbimento (PlasmaSelect, Teterow, Germania). Secondo, cardiomiociti adulti sono isolati mediante perfusione con collagenasi in un apparato perfusione Langendorff utilizzando apROTOCOLLO modificato da lavori precedenti ^10,11. I cardiomiociti ottenuti sono allegati alla laminina rivestite chambered vetrini colorati con Fura-2, un inibitore selettivo colorante fluorescente che può essere facilmente portato nella cella di osservare intracellulare di calcio (Ca ^{2 +)} contenuti ^12. Nell'ultimo passaggio, l'effetto del paziente IgG sulla riduzione delle cellule e Ca ^{2 +} transitori di cardiomiociti campo stimolate è monitorato on-line utilizzando un calcio commerciale miociti e sistema di monitoraggio contrattilità (IonOptix, Milton, MA, USA) collegato ad una fluorescente standard di inversa microscopio.

Protocollo

1. Isolamento IgG da campioni di pazienti

1. Preparare mini-immunoassorbimento colonne di riempimento 3 ml di anti-IgG sepharose paziente per 2 ml di plasma EDTA in una colonna vuota Econo Pac. IgG isolamento richiede almeno 2 ml di plasma del paziente.
2. Collocare un filtro sopra l'anti-IgG Sepharose, tagliare aprire l'estremità inferiore della colonna e premere il filtro per raggiungere una portata di circa 1 goccia / sec. Lasciare la soluzione di conservazione corto di colonna.
3. Lavare la colonna con 3 volumi NaCl 0,9% per volume di plasma.
4. Pipettare il plasma sulla colonna. Quando il plasma è completamente immerso nel an....

Risultati

Due esempi per la misurazione di inotropismo cellulare nel campo stimolato cardiomiociti adulti (figura 2) utilizzando una miociti Ca ^{2 +} e registrazione contrattilità sono riportati di seguito. Figura 3 dà l'impressione di una misura di controllo, mentre in figura 4 l'effetto di anticorpi cardiodepressive di un paziente con DCM è mostrato.

In entrambi gli esempi, accorciamento cellula iniziale e Ca ^{2 +} transito.......

Discussione

Il metodo proposto offre un modo adatto a rilevare autoanticorpi funzionalmente efficaci cardiaci in pazienti con DCM di origine poco chiara. In confronto ad altri metodi, ad esempio il rilevamento di anticorpi funzionali attivi contro l'β1-adrenocettori da loro impatto sui livelli di cAMP ^6, il nostro metodo è indipendente da uno specifico epitopo. Naturalmente ci sono altri saggi indipendenti epitopi descritti nella letteratura, cioè contando il tasso battendo cardiomiociti neonatali d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente / attrezzature	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Immunosorba conservazione soluzione	Fresenius Medical Care	903609211
Collagenasi di tipo 2	Cella di sistema	LS004176
BSA, acidi grassi liberi	Sigma-Aldrich	A6003
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Fura-2 AM	Sigma-Aldrich	F0888	1 mg / ml in DMSO
Econo Pac Cromatografia Colonne	BioRad	732-1010
Spectra / Por Biotech Cellulosa Ester dialisi Membrane	Spectrumlabs	131417
4 ben Chambered vetrino	Nunc	155383
Calcio miociti e Sistema di registrazione contrattilità	IonOptix
IonWizard 6,0 ​​software di analisi	IonOptix