Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

Summary

Il metodo proposto offre un modo per rilevare funzionali autoanticorpi cardiotropic efficaci nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa, indipendentemente l'antigene specifico, analizzando l'impatto di immunoglobulina paziente isolato su accorciamento cellulare e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti isolati di ratto.

Abstract

Cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle principali cause di insufficienza cardiaca nei giovani adulti ^1. Sebbene predisposizione genetica ed esposizione a sostanze tossiche sono note cause per questa malattia in circa un terzo dei pazienti, l'origine di DCM rimane poco chiara. In un numero considerevole di questi pazienti, gli anticorpi contro epitopi cardiaci sono stati individuati e sono sospettati di svolgere un ruolo centrale nella insorgenza e la progressione della malattia ^2,3. L'importanza di autoanticorpi cardiache è sottolineata da un miglioramento emodinamico osservato nei pazienti DCM dopo l'eliminazione di autoanticorpi da immunoassorbimento ^3-5. Una varietà di antigeni specifici sono già stati individuati ^2,3 e anticorpi contro tali obiettivi possono essere rilevati da immunosaggi. Tuttavia, questi test non può discriminare tra stimolante (e quindi funzionalmente efficaci) e bloccando autoanticorpi. Vi è una crescente evidence che questa distinzione è cruciale ^6,7. Si può anche ritenere che gli obiettivi di un certo numero di anticorpi cardiotropic sono ancora da identificare e pertanto non può essere rilevato dal test immunologici. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per la rilevazione di anticorpi funzionalmente attivi cardiotropic, indipendentemente dal loro rispettivo antigene. Lo sfondo per il metodo è l'alta omologia di solito osservata per le regioni funzionali di proteine ​​cardiache nei mammiferi tra ^8,9. Questo suggerisce che gli anticorpi diretti contro antigeni cardiaci umani reazione crociata con non umani cellule bersaglio, che permette prove di IgG da pazienti DCM su cardiomiociti di ratto adulto. Il nostro metodo si compone di 3 fasi: la prima, IgG è isolato dal plasma del paziente con sefarosio accoppiati anti-IgG anticorpi ottenuti da colonne immunoassorbimento (PlasmaSelect, Teterow, Germania). Secondo, cardiomiociti adulti sono isolati mediante perfusione con collagenasi in un apparato perfusione Langendorff utilizzando apROTOCOLLO modificato da lavori precedenti ^10,11. I cardiomiociti ottenuti sono allegati alla laminina rivestite chambered vetrini colorati con Fura-2, un inibitore selettivo colorante fluorescente che può essere facilmente portato nella cella di osservare intracellulare di calcio (Ca ^{2 +)} contenuti ^12. Nell'ultimo passaggio, l'effetto del paziente IgG sulla riduzione delle cellule e Ca ^{2 +} transitori di cardiomiociti campo stimolate è monitorato on-line utilizzando un calcio commerciale miociti e sistema di monitoraggio contrattilità (IonOptix, Milton, MA, USA) collegato ad una fluorescente standard di inversa microscopio.

Protocol

1. Isolamento IgG da campioni di pazienti

1. Preparare mini-immunoassorbimento colonne di riempimento 3 ml di anti-IgG sepharose paziente per 2 ml di plasma EDTA in una colonna vuota Econo Pac. IgG isolamento richiede almeno 2 ml di plasma del paziente.
2. Collocare un filtro sopra l'anti-IgG Sepharose, tagliare aprire l'estremità inferiore della colonna e premere il filtro per raggiungere una portata di circa 1 goccia / sec. Lasciare la soluzione di conservazione corto di colonna.
3. Lavare la colonna con 3 volumi NaCl 0,9% per volume di plasma.
4. Pipettare il plasma sulla colonna. Quando il plasma è completamente immerso nel anti-IgG Sepharose, lavare con lo stesso volume 0,9% NaCl.
5. Pipetta un volume plasmatico di 0,2 M glicina HCl, pH 2,8 su colonna e lasciare immergere nel Sepharose. Aggiungere un altro volume di glicina HCl sulla colonna. Raccogliere il flusso attraverso un tubo 15 ml e regolare il pH a 7,3 con 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
6. Per rigenerare la colonna, Lavare con 3 volumi di plasma glicina HCl. Dopo un lavaggio finale con 2 volumi 0,9% NaCl, la colonna può essere utilizzato per il campione di plasma successivo. In alternativa, la colonna può essere riempita di soluzione di conservazione e conservata a 4-8 ° C fino a 4 settimane.
7. Per uso su cardiomiociti, la frazione IgG collezionati deve essere dializzato contro tampone sperimentale (EB). Per la preparazione della EB, aggiungere 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 _mM MgCl2, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1.2 mM CaCl _2, 10 mM HEPES e 20 mM di glucosio ad 1 L di acqua distillata su un agitatore magnetico e regolare il pH a 7,3.
8. Riempire la frazione IgG di un tubo estere di cellulosa membrana di dialisi con un peso molecolare tagliato di 100 kDa. Mettere il tubo in 1 L EB e mescolare lentamente con un agitatore magnetico a 4 ° C. Dopo 8 ore, trasferire il tubo di dialisi in 3 L di EB fresco e dializza per un'altra ora e 20 a 4 ° C.
9. Seguendo la dialisi, il calore del campione per 30 min a 57 ° C in un bagno d'acqua a inactivatposta complemento fattori. Determinare la concentrazione totale di IgG e preparare aliquote di 330 mg ogni IgG. Quando si aggiunge il campione di cardiomiociti di misura (fase 4.3), riempire le aliquote di 1 ml con EB. Aliquote non diluiti possono essere conservati a -20 ° C fino ad ulteriore utilizzo.

2. Isolamento di cardiomiociti di ratto

1. Per la preparazione di Ca ^{2 +-tampone} privo di isolamento (IB), aggiungere 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM HEPES e 11 mM di glucosio ad 1 L di acqua distillata con un magnetico agitatore. Portare il pH a 7,4, a temperatura ambiente e filtrare attraverso un filtro 0,2 micron top bottiglia per la sterilizzazione.
2. Riempire 80 ml di IB nel serbatoio superiore di un sistema di perfusione Langendorff termostatata. Regolare le impostazioni del termostato per mantenere una temperatura di buffer di 37 ° C e aerare buffer con 95% O _2/5% di CO ₂ per 30 min.
3. Pesare circa 10.000 - 12.000 U di collagenase tipo II, 175 mg di acidi grassi liberi BSA e si sciolgono in 20 ml contenenti IB 22,5 pl di una mm 100 _CaCl2 soluzione madre. Controllare il pH del tampone di isolamento nel serbatoio superiore e regolare se necessario.
4. Anestetizzare un ratto Wistar di 175 - 200 g con 375 mg / kg di peso corporeo tiopentale. Aggiungi 2500 UI di eparina alla soluzione tiopentale. Dopo toracotomia, accisa il cuore con cura con un arco aortico intatto e le trasferisce in gelata NaCl 0,9%. Pulire il cuore da sangue e tessuto circostante e trasferimento a fresco 0,9% NaCl. Esporre l'aorta, aprire il riduttore di flusso del sistema Langendorff per ottenere una velocità di gocciolamento di 2-3/sec e attaccare il cuore alla cannula.
5. Perfondere il cuore fino a 3 minuti con una portata di 1 goccia / sec per lavare il sangue rimanente. Inizia a circolare le IB nel sistema Langendorff. Rimuovere 20 ml di tampone dal serbatoio superiore, caricare la soluzione collagenasi e riempire come buffer quanto necessario per raggiungere 80 ml. Far circolare il c ollagenase soluzione per un altro 27 min. Portata deve essere controllata periodicamente e mantenuta a 1 goccia / sec utilizzando il riduttore di flusso.
6. Staccare il cuore dalla cannula, pulito da atri e aorta e tagliare in piccoli pezzi. Lasciare che la soluzione di collagenasi di scorrere nel serbatoio inferiore, ridurre il volume ad un massimo di 40 ml e in seguito digerire i ventricoli tritate per 10 - 15 minuti sotto aerazione continua con il 95% O _2/5% di CO _2. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare con una garza 200 micron dimensione delle maglie in una provetta da 50 ml.
7. Ripristinare il Ca ^{2 +} contenuto delle celle in 3 fasi: centrifugare la sospensione cellulare a 43 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e risospendere le cellule in 10 ml contenenti IB 200 mM CaCl _2. Centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 10 ml IB con 500 mM CaCl _2. Dopo una centrifugazione finale risospendere in cardiomiociti EB filtrata sterile (vedi 1.8) ad una densità di 50.000 cellule / ml.

e_title "> 3. Fura-2 colorazione dei cardiomiociti

1. Cappotto a 4 coprioggetti ben camerata con 10 laminina pg per bene e attendere che sia completamente asciugato.
2. Riempire 1 ml della sospensione cardiomiocita in ogni pozzetto usando una micropipetta con una punta di taglio. Permettere alle cellule di aderire per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Diluire 10 ml di 1 mg / ml Fura-2 AM soluzione madre in 5 ml di EB. Conservare la soluzione di colorazione al buio.
4. Togliere celle buffer e distaccato dal coprioggetto e pipettare 0,5 ml di soluzione colorante in ogni pozzetto. Incubare le cellule per 10 minuti sotto agitazione moderata. Successivamente, togliere la soluzione colorante, lavare le cellule una volta con 1 ml di EB e riempire EB 0,5 ml in tutti i pozzetti. Evitare la luce diretta durante il processo di colorazione e tenere sempre le cellule colorate al buio.

4. Registrazione di accorciamento cellulare e Ca ^{2 +} transitori

1. Posizionare il coprioggetto a camera su un m inversa fluorescenzaicroscope collegato ad un calcio miociti e sistema di registrazione contrattilità. Posizionare un elettrodo di misura con un afflusso ed efflusso del tubo nel primo pozzetto. Cardiomiociti Superfuse con 1 ml / min EB e iniziare la stimolazione elettrica (20 V, 1 Hz, durata di 5 msec). Permettere alle cellule di adattarsi alla stimolazione per circa 2 min.
2. Scegli una cardiomiociti intatto a forma di asta con striatura chiara e costante contrazione. Posizionare la cella al centro del campo visivo e aprire il canale. Orientare la cella orizzontalmente all'interno dell'area video ruotando l'adattatore inquadratura cella e spostando la fase microscopio.
3. Regolare il bordo rilevare elementi di controllo della zona video (Figura 2), aprire il canale fluorescente e registrare 10-15 contrazioni per ottenere la riduzione iniziale delle cellule e Ca ^{2 +} transitori.
4. Chiudere il canale di luce del microscopio per evitare sbiancamento della macchia fluorescenza. Accendere il flusso attraverso da EB al campionebypass con una valvola a 3 vie e cardiomiociti superfuse con 1 ml di IgG paziente. Fermare la pompa poco prima che l'aria raggiunga il bene.
5. Aprire il canale di luce e registrarne un altro 10-15 contrazioni per ottenere la risposta acuta cella. Mettere in pausa la registrazione e chiudere il canale di nuovo luce. Ripetere la registrazione dopo 2 e 5 min.
6. Estrarre l'elettrodo di pozzo. Pulire accuratamente le provette con EB e continuare con il pozzo successivo del coprioggetti incamerata.
7. Analizzare l'accorciamento cella e Ca ^{2 +} temporaneo con il software IonWizard utilizzando il "Edge-Length/Length" e la finestra "fura 2-numerico sottratto / Ratio", rispettivamente. Calcolare la variazione percentuale dal accorciamento cellula iniziale e Ca ^{2 +} transitoria dell'altezza del picco cui la linea di base (bl% picco h) per l'acuta, il 2 min e la risposta di 5 min.

Results

Due esempi per la misurazione di inotropismo cellulare nel campo stimolato cardiomiociti adulti (figura 2) utilizzando una miociti Ca ^{2 +} e registrazione contrattilità sono riportati di seguito. Figura 3 dà l'impressione di una misura di controllo, mentre in figura 4 l'effetto di anticorpi cardiodepressive di un paziente con DCM è mostrato.

In entrambi gli esempi, accorciamento cellula iniziale e Ca ^{2 +} transitori duran...

Discussion

Il metodo proposto offre un modo adatto a rilevare autoanticorpi funzionalmente efficaci cardiaci in pazienti con DCM di origine poco chiara. In confronto ad altri metodi, ad esempio il rilevamento di anticorpi funzionali attivi contro l'β1-adrenocettori da loro impatto sui livelli di cAMP ^6, il nostro metodo è indipendente da uno specifico epitopo. Naturalmente ci sono altri saggi indipendenti epitopi descritti nella letteratura, cioè contando il tasso battendo cardiomiociti neonatali d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / attrezzature	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Immunosorba conservazione soluzione	Fresenius Medical Care	903609211
Collagenasi di tipo 2	Cella di sistema	LS004176
BSA, acidi grassi liberi	Sigma-Aldrich	A6003
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
Fura-2 AM	Sigma-Aldrich	F0888	1 mg / ml in DMSO
Econo Pac Cromatografia Colonne	BioRad	732-1010
Spectra / Por Biotech Cellulosa Ester dialisi Membrane	Spectrumlabs	131417
4 ben Chambered vetrino	Nunc	155383
Calcio miociti e Sistema di registrazione contrattilità	IonOptix
IonWizard 6,0 ​​software di analisi	IonOptix