Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Sommario

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Abstract

Comprendere le proprietà biofisiche e l'organizzazione funzionale dei neuroni singoli e come informazioni di processo è fondamentale per capire come funziona il cervello. La funzione primaria di qualsiasi cellula nervosa è di elaborare i segnali elettrici, solitamente da più fonti. Proprietà elettriche dei processi neuronali sono straordinariamente complessa, dinamica, e, nel caso generale, impossibile prevedere in assenza di misurazioni dettagliate. Per ottenere tale misurazione si sarebbe, idealmente, come essere in grado di monitorare, in più siti, eventi sottosoglia mentre viaggiano dai siti di origine sui processi neuronali e sommare in posizioni particolari di influenzare iniziazione potenziale d'azione. Questo obiettivo non è stato raggiunto in un neurone a causa di limitazioni tecniche di misurazioni che utilizzano elettrodi. Per superare questo inconveniente, è altamente desiderabile per integrare la patch-elettrodo approccio con tecniche di imaging che permettono ampia Recordin parallelogs da tutte le parti di un neurone. Qui, descriviamo una tecnica - ottico di registrazione dei transitori potenziale di membrana con organici tensione coloranti sensibili (V _m-imaging) - caratterizzati da sub-millisecondo e sub-micrometrica risoluzione. Il nostro metodo si basa sul lavoro pionieristico di sonde molecolari tensione-sensibili ^2. Molti aspetti della tecnologia iniziale sono stati continuamente migliorati per decenni ^{3, 5, 11.} Inoltre, lavoro precedente documentato due caratteristiche essenziali di V _m-imaging. In primo luogo, i segnali di fluorescenza sono linearmente proporzionale al potenziale di membrana su tutta la gamma fisiologica (-100 mV a +100 mV, ^{10, 14, 16).} In secondo luogo, i neuroni di carico con la tensione di colorante sensibile usato qui (JPW 3028) non ha effetti farmacologici rilevabili. L'ampliamento del picco registrato durante il caricamento del colorante è completamente reversibile ^{4, 7.} Inoltre, prove sperimentali mostrano che è possibile ottenereun numero significativo (fino a centinaia) di registrazioni prima di eventuali effetti rilevabili fototossiche ^{4, 6, 12, 13.} Attualmente, sfruttare la luminosità eccezionale e stabilità di una sorgente di luce laser a lunghezza d'onda quasi ottimale per massimizzare la sensibilità della _m-imaging tecnica V. La sensibilità attuale consente registrazioni di più siti di ottica di V transitori _m da tutte le parti di un neurone, tra assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e spine dendritiche individuali. Le informazioni acquisite sulle interazioni di segnale possono essere analizzati quantitativamente e direttamente visualizzati sotto forma di un film.

Protocollo

1. Impostazione dell'apparecchiatura

Passo 1.1. Imaging di installazione

La chiave per la registrazione dei segnali di tensione colorante sensibili è la progettazione di configurazione appropriato. Usiamo un microscopio in posizione verticale (BX51WI Olympus o AxioExaminer Zeiss) dotato di tre telecamere. L'installazione è stata progettata per l'illuminazione di singoli neuroni in fettine di cervello di luce di eccitazione in epi-fluorescenza, wide-field modalità microscopia utilizzando sia 60X/1.0 Nikon NA o Zeiss 63X/1.0 acqua NA obiettivi immersione. Nostri microscopi sono imbullonati a una tabella di isolamento di vibrazione e dotate motorizzati fasi mobili. Ogni microscopio è dotato di tre porte fotocamera. Una porta fotocamera è dotata di un elevato standard risoluzione spaziale camera CCD per DIC video-microscopia a raggi infrarossi (IR-1000, Dage MTI, USA). La porta ha una seconda fotocamera veloce acquisizione dei dati della telecamera (fino a 20 frame rate kHz) con relativamente bassa risoluzione spaziale (80 x 80 pixel), ma eccezionale gamma dinamica (14 bit) e eccezionalmente basso leggererumore (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). La terza porta fotocamera ha una fotocamera CCD ad alta risoluzione spaziale (PixelFly, 1392x1024 pixel, PCO AG, Germania) montato su un disco rotante-scanner confocale (CSU-10, Yokogawa, Giappone) utilizzato per raccogliere z-stacks di immagini confocali per dettagliata ricostruzione morfologica della cellula colorata. Un diodo a frequenza doppia-pompato Nd: YVO4 laser ad onda continua (400 mW) che emette a 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Cina) è la sorgente di luce di eccitazione. Il diametro di 2 millimetri fascio laser gated da un otturatore (LS6; Associates Vincent) è diretta ad una guida di luce accoppiato al microscopio tramite una singola porta condensatore epifluorescenza (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Germania) progettati per riempire completamente l'apertura posteriore del obiettivo e fornire un'illuminazione uniforme prossimità del piano oggetto. La luce laser viene utilizzato al posto di un convenzionale lampada Xenon ad arco per massimizzare la sensibilità del V _m-imaging da: (1) usando un ex monocromaticaluce citazione all'ala rossa dello spettro di assorbimento di massimizzare V _m sensibilità del colorante ^{9, 10} e (2) aumentare l'intensità della luce di eccitazione oltre il livello che può essere raggiunto da una lampada ad arco. La luce di eccitazione è riflessa alla preparazione da uno specchio dicroico con una lunghezza d'onda centrale di 560 nm e la luce di fluorescenza registrata fatto passare attraverso un filtro barriera 610 nm (a Schott RG610). L'effetto combinato di un aumento dell'intensità della luce e l'utilizzo di lunghezze d'onda ottimali vicino eccitazione monocromatiche era un drammatico miglioramento della sensibilità di imaging tensione di un fattore di circa 50 rispetto alle misurazioni precedenti ^6.

Passo 1,2. Regolare per un'illuminazione uniforme

Utilizzare uno standard fluorescenza diapositiva (eccitazione verde / emissione rossa). Inserire opportuni filtri di densità neutri nel percorso del raggio laser in modo che il CCD non è saturo. Focalizzare l'obiettivo sulla superficiela diapositiva. Regolare la posizione del lato di ricezione della guida di luce quarzo davanti all'obiettivo lanciatore laser, e regolare la posizione della estremità di uscita della guida di luce collegato al microscopio mediante opportuni attuatori sulla epi-fluorescenza condensatore per ottenere centrato ed uniforme illuminazione del campo di vista.

Passo 1.3. Determinare il rumore vibrazionale

Inserire un segno piccola inchiostro nero sulla superficie del vetrino fluorescenza. Registrare l'intensità della luce con NeuroCCD nella modalità di registrazione continua. Mettere a fuoco l'obiettivo su un bordo scuro del marchio inchiostro nero. Registrare l'intensità luminosa per circa 100 msec a 2 kHz di frequenza di fotogrammi. Visualizzare la media spaziale delle tracce frazionari intensità luminosa (Af / F) di ~ 20 pixel che ricevono luce dalla zona illuminata uniformemente e da circa 20 pixel lungo il bordo del marchio inchiostro. Il rumore in eccesso nelle registrazioni da pixel con bordi ad alto contrasto riflette il rumore vibrazionale inil sistema.

Passo 1.4. Vibrazioni isolamento

È obbligatorio per ridurre le vibrazioni utilizzando una tavola di isolamento vibrazioni ad un livello inferiore al rumore di sparo con intensità di luce paragonabili a condizioni di registrazione sperimentali. Regolare la tavola di isolamento delle vibrazioni finché il rumore di vibrazione in dell'intensità luminosa da pixel che coprono il bordo tagliente dell'immagine è trascurabile. Nessuna delle apparecchiature con parti mobili (persiane, ventilatori meccanici) può essere montato sulla tavola. I cavi dal materiale sulla tavola allegata ad altri componenti che non sono isolati dalle vibrazioni devono essere allentato in modo che non trasmettono vibrazioni meccaniche al microscopio.

2. Selezione di un Neuron Adeguato per V _m-Imaging

Passo 2.1. Selezione di neuroni

Rendere fettine cerebrali secondo procedure standard. Utilizzare una linea di topi esprimono EGFP in singole cellule nervose di iINTERESSE. Con un sistema di rotazione del disco confocale, visualizzare i neuroni EGFP marcati nella sezione. Selezionare neuroni per V _m-imaging con intatte dendritiche / assonale alberi, e con processi parallelo e vicino alla superficie della fetta. Ciò non può essere realizzato in topi selvatici perché assoni e dendriti sottili, per la maggior parte, non sono visibili in modalità microscopia DIC.

3. Neuroni di carico con tensione sensibile Dye

Passo 3.1. Riempimento della pipetta di patch

Riempire pipette di patch vetro dalla punta con colorante senza soluzione intracellulare applicando pressione negativa per circa 15 s fino a 2/3 del cono dell'elettrodo. La soluzione colorante libero in punta è necessaria per evitare la fuoriuscita del colorante sulla fetta che aumenta la fluorescenza di fondo e riduce drasticamente rapporto segnale-rumore. Back-riempire l'elettrodo con la soluzione contenente il colorante impermeant membrana sensibile tensione JPW3028 discioltoin soluzione intracellulare (0,8 mM).

JPW3028, la sonda di tensione di maggior successo per l'applicazione intracellulare, è un analogo doppiamente carica positiva del ANEP serie di coloranti lipofili stirilici ancora sufficientemente solubile in acqua da utilizzare per microiniezione. Il di-etil analogica di questo colorante è praticamente identiche caratteristiche (inclusa la tensione-sensibilità) ed è disponibile in commercio come JPW1114 (vedi Tabella 1). Prepariamo soluzione stock 20 mM in acqua distillata H ₂ O. Aliquote di 50 microlitri della soluzione stock sono conservati congelati a -20 ° C. Per la concentrazione di colorante finale di 0,8 mM, 2 ml di soluzione madre viene sciolto in 50 ml di soluzione intracellulare nel giorno dell'esperimento. La soluzione colorante magazzino è stabile e può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi. Pertanto, manteniamo uno aliquota 50 microlitri a temperatura ambiente fino al suo esaurimento.

Passo 3.2. Stabilire una giga-sigillo in fretta

Patch un neurone selezionato in precedenza e consentire libera diffusione del colorante da una pipetta di patch somatica al soma in configurazione whole-cell per 20-45 min. È essenziale ottenere una tenuta più velocemente possibile in modo che la quantità di colorante libero in soluzione la punta può essere piccola. Inizia la pratica patch veloce senza il colorante nella elettrodo. Successivo, patch pratica e caricamento neuroni con il colorante con l'obiettivo di utilizzare una quantità minima di colorante libero in soluzione punta senza contaminare il tessuto circostante. Con la pratica, è possibile creare una tenuta entro 1-2 min.

Passo 3.3. Monitorare il livello di colorazione

Durante la diffusione colorante nella configurazione whole-cell, monitorare lo stato fisiologico del neurone registrando potenziali d'azione evocati in current-clamp mode. Inoltre, controllare la quantità di colorazione registrando l'intensità della luce di riposo (RLI) dal soma cellulare a un frame rate di 2 k Hz e ad una frazione di intensità luminosa piena regolata con filtri a densità neutra (usiamo 0,04% dell'intensità della luce laser da un laser 400 mW). Continuare il processo di tintura carico fino al potenziale di azione inizia ad ampliare, di solito dopo 20-40 minuti, a seconda della dimensione e resistenza dell'elettrodo.

L'ampliamento del picco è completamente reversibile e molto probabilmente a causa dell'effetto di carico capacitivo della concentrazione del colorante saturi nella membrana somatica. La forma d'onda del picco viene completamente ripristinata dopo la concentrazione di colorante è equilibrata tutto il neurone.

Passo 3.4. Rimuovere l'elettrodo colorante

Alla fine del periodo di colorazione, tirare la pipetta cerotto dalla soma in configurazione voltage clamp garantire che la transizione da cellule intere di fuori-out configurazione patch viene raggiunto nel processo.

Passo 3,5. Attendere per la diffusione colorante

ent "> Incubare la fetta per un ulteriore 1,5-2 ore a temperatura ambiente per permettere la tensione colorante sensibile a diffondersi in processi neuronali. Dopo una notevole quantità di colorante diffonde dal soma in processi dendritiche e assonali, la forma d'onda di l'AP è completamente ristrutturato.

4. Registrazione ottica

Passo 4.1. Selezionare un compartimento cellulare per l'imaging

Individuare la soma del neurone colorato con fluorescenza a basso livello di luce e ri-patch il neurone con uno standard (senza colorante) elettrodo patch nell'ambiente DIC. Visualizza processi neuronali sotto il livello di scarsa luminosità a un frame rate di 10-40 Hz in modalità di registrazione continua del CCD per tensione-imaging. Ridurre il livello di luce con filtri a densità neutra al minimo richiesto per visualizzare l'oggetto di interesse. Usiamo 0,01% dell'intensità laser 400 mW durante il posizionamento del neurone macchiato. Utilizzando uno stadio XY, posizionare il processo neuronale di interesse in tegli centro l'area di esposizione. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione con il diaframma parzialmente chiuso fermata campo del microscopio. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione ad alta intensità riduce in modo significativo i danni fotodinamica durante la registrazione.

Passaggio 4.2 segnali Record ottiche relative ai transitori potenziale di membrana

Registrare segnali ottici relativi a punti di accesso backpropagated nei singoli rami dendritici. Registrare segnali ottici relativi punti di accesso nel assone. Registrare segnali ottici legati alla backpropagating AP in spine dendritiche. Utilizzare frame rate adeguate per la ricostruzione accurata della forma d'onda del segnale e mantenere i periodi di registrazione e l'esposizione alla luce ad alta intensità di eccitazione più corti possibile per ridurre al minimo colorante sbianca e danni fotodinamica. Ad esempio, esaminando la sequenza di iniziazione e propagazione dei potenziali d'azione unico nel assone richiede periodi di registrazione di 5-10 msec. L'eccitazione luce intenty durante la registrazione è un compromesso tra il rapporto segnale-rumore, da un lato e il grado di tintura candeggio e danni fotodinamica dall'altro. Usiamo 100% di intensità del laser 400 mW in registrazione da lunghi tratti di assoni quando un'area di 300 micron di diametro è illuminato. Quando la luce di eccitazione è focalizzato ad una zona 30 micron di diametro per l'imaging spina dendritica, usiamo 10-25% dell'intensità della luce laser. La durata della registrazione è un fattore determinante l'intensità ottimale luce di eccitazione; periodi di registrazione più brevi consentono intensità di luce più elevate. L'intensità di illuminazione ottimale è meglio determinata empiricamente per ogni preparazione e le impostazioni di misurazione.

5. Analisi dei dati

Passo 5.1. Correggere i dati grezzi per errori noti

L'analisi e la visualizzazione dei dati sono state effettuate utilizzando il programma NeuroPlex (RedShirtImaging) scritto in IDL (ITT Visual Information Solutioni, Boulder, Colorado) e personalizzati routine di Visual Basic. Nelle condizioni di scarsa luminosità, la fluorescenza di fondo diventa un fattore determinante della Af / F dimensioni del segnale. I dati grezzi sono stati corretti per questo effetto sottraendo la media intensità di fluorescenza di fondo determinato da una zona non colorato sulla fetta. Successivamente, il software di allineamento dei segnali è stato utilizzato per correggere jitter temporale in AP iniziazione e per eventuali piccoli movimenti della preparazione durante media. Nel dominio temporale, segnali di AP sono stati allineati da cross correlazione degli AP elettricamente registrato in ogni prova al segnale di riferimento acquisita all'inizio della media (Figura 1B). Nel dominio spaziale, le immagini sono state allineate in due dimensioni offline per immagine cross-correlazione per compensare eventuali piccoli movimenti laterali della preparazione. La corretta messa a fuoco dell'immagine nel z-dimensione è stato verificato prima di ogni prova individuale; smal rettifiche l erano spesso necessario. I segnali spazialmente e temporalmente allineati stati mediati come mostrato in figura 1B. Lenti cambiamenti di intensità luminosa dovuta allo sbiancamento del colorante sono stati corretti dividendo i dati da un opportuno duplice funzione esponenziale derivata dagli studi di registrazione senza stimolazione (Figura 1B). La forma d'onda del segnale di AP è stato ricostruito da un insieme di punti di dati utilizzando Cubic Spline interpolazione, una curva continua a tratti passante per ciascun punto di dati. Per confermare che la tensione di segnale sensibile colorante tracce potenziale di membrana senza distorsione significativa alla scala temporale millisecondo, il segnale elettrico dal soma AP è stato confrontato con il segnale ottico AP dal poggio assone adiacente come mostrato in figura 3B. I due segnali si sovrappongono molto da vicino, consentendo il rumore colpo ottico di registrazione.

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Figura 1. Analisi dei dati (Animazione). (A) Pannello superiore: immagine ad alta risoluzione confocale macchiato di un neurone con assone nella posizione di registrazione. Elettrodo di registrazione allegata alla soma ed extracellulare elettrodo stimolante accanto dendrite basale schematizzato. I potenziali d'azione evocati da extracellulare, la stimolazione sinaptica. Pannello inferiore: immagine a bassa risoluzione spaziale di fluorescenza della assone ottenuta con CCD utilizzata per l'imaging V _m (B) registrazioni elettrodo da soma (tracce nere), registrazioni ottiche da AIS (tracce rosse) e dal nodo di Ranvier (tracce verdi). . Tracce Top: i dati grezzi da 9 studi che mostrano il jitter temporale in AP iniziazione. Seconda fila di tracce: allineato temporalmente segnali. Terza fila di tracce: segnale medio. Quarta fila di tracce: correzione candeggina. Tracce di fondo: interpolazione spline cubica con un passaggio di smoothing temporale.

Risultati

Successo microscopia confocale dovrebbe consentire una chiara identificazione dei processi neuronali intatti che sono vicino alla superficie della fetta e situato in un piano di messa a fuoco. La selezione delle cellule nervose che sono appropriate per l'imaging di tensione prima della voltaggio-dipendenti carico colorante è fondamentale. Un esempio di immagini confocali di L5 neuroni piramidali esprimono EGFP in una fetta corticale (Crym transgenico linea mouse) è mostrato in Figura 2. Gli assoni dei n...

Discussione

Questo articolo descrive un voltaggio-dipendenti metodo di registrazione colorante per monitorare l'attività elettrica dei neuroni individuali con sub-micrometrica e sub-millisecondo risoluzione spazio-temporale. Eccitazione laser a lunghezza d'onda quasi ottimale (considerando le dimensioni segnale) migliorato la sensibilità di registrazione di un fattore ~ ​​50 rispetto agli approcci precedenti. La sensibilità attuale consente il monitoraggio dei segnali elettrici da tutte le parti di neuroni individuali, tra ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del componente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
			Installazione componenti
Microscopio verticale	Olympus Inc.	BX51WI	Con tre porte della fotocamera
Motorizzato mobile stage	Siskiyou	MXOPi.2
Epi-fluorescenza condensatore per Olympus BX51	TILL Photonics	0000-560-11659
Microscopio verticale	Carl Zeiss, LLC	AxioExaminer D1	Con tre porte della fotocamera
Motorizzato piastra superiore	Scientifica limitata	MMBP
Epi-fluorescenza a condensatore per Zeiss AxioExaminer	TILL Photonics
Acquisizione Dati Camera	RedShirtImaging LLC	NeuroCCD-SM	Ad alta velocità, a basso rumore di lettura
CCD per IR-DIC	Dage-MTI	IR-1000
Spinning-Disc scanner confocale	Yokogawa	CSU-10
CCD ad alta risoluzione spaziale nello scanner confocale	PCO AG	PixelFly	1392x1024 pixel
DPSS laser CW (532 Nm)	CNI Optoelettronica Tech. Co., Ltd	MLL-III-532 400mW	Eccitazione sorgente di luce
Fibra multi-mode Launcher	Siskiyou	SM-CFT
Light Guide	FINO Fotonic	0000-515-11524
Otturatore	Vincent Associates	LS6
Vibrazioni isolamento Tabella	Minus k Tecnologia	MK26
			Reagenti specifici
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114)	Life Technologies	D-6923	Tensione colorante sensibile
Crym-EGFP mouse Linea	GENSAT (MMRRC)	STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd	Scarsamente esprimere EGFP nel livello 5 neuroni corticali