Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Marko Popovic; Xin Gao; Dejan Zecevic

doi:10.3791/4261

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Articolo metodologico

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

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DOI:

10.3791/4261

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29 novembre 2012

Marko Popovic¹ , Xin Gao¹ , Dejan Zecevic¹

¹Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Abstract

Comprendere le proprietà biofisiche e l'organizzazione funzionale dei neuroni singoli e come informazioni di processo è fondamentale per capire come funziona il cervello. La funzione primaria di qualsiasi cellula nervosa è di elaborare i segnali elettrici, solitamente da più fonti. Proprietà elettriche dei processi neuronali sono straordinariamente complessa, dinamica, e, nel caso generale, impossibile prevedere in assenza di misurazioni dettagliate. Per ottenere tale misurazione si sarebbe, idealmente, come essere in grado di monitorare, in più siti, eventi sottosoglia mentre viaggiano dai siti di origine sui processi neuronali e sommare in posizioni particolari di influenzare iniziazione potenziale d'azione. Questo obiettivo non è stato raggiunto in un neurone a causa di limitazioni tecniche di misurazioni che utilizzano elettrodi. Per superare questo inconveniente, è altamente desiderabile per integrare la patch-elettrodo approccio con tecniche di imaging che permettono ampia Recordin parallelogs da tutte le parti di un neurone. Qui, descriviamo una tecnica - ottico di registrazione dei transitori potenziale di membrana con organici tensione coloranti sensibili (V _m-imaging) - caratterizzati da sub-millisecondo e sub-micrometrica risoluzione. Il nostro metodo si basa sul lavoro pionieristico di sonde molecolari tensione-sensibili ^2. Molti aspetti della tecnologia iniziale sono stati continuamente migliorati per decenni ^{3, 5, 11.} Inoltre, lavoro precedente documentato due caratteristiche essenziali di V _m-imaging. In primo luogo, i segnali di fluorescenza sono linearmente proporzionale al potenziale di membrana su tutta la gamma fisiologica (-100 mV a +100 mV, ^{10, 14, 16).} In secondo luogo, i neuroni di carico con la tensione di colorante sensibile usato qui (JPW 3028) non ha effetti farmacologici rilevabili. L'ampliamento del picco registrato durante il caricamento del colorante è completamente reversibile ^{4, 7.} Inoltre, prove sperimentali mostrano che è possibile ottenereun numero significativo (fino a centinaia) di registrazioni prima di eventuali effetti rilevabili fototossiche ^{4, 6, 12, 13.} Attualmente, sfruttare la luminosità eccezionale e stabilità di una sorgente di luce laser a lunghezza d'onda quasi ottimale per massimizzare la sensibilità della _m-imaging tecnica V. La sensibilità attuale consente registrazioni di più siti di ottica di V transitori _m da tutte le parti di un neurone, tra assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e spine dendritiche individuali. Le informazioni acquisite sulle interazioni di segnale possono essere analizzati quantitativamente e direttamente visualizzati sotto forma di un film.

Protocollo

1. Impostazione dell'apparecchiatura

Passo 1.1. Imaging di installazione

La chiave per la registrazione dei segnali di tensione colorante sensibili è la progettazione di configurazione appropriato. Usiamo un microscopio in posizione verticale (BX51WI Olympus o AxioExaminer Zeiss) dotato di tre telecamere. L'installazione è stata progettata per l'illuminazione di singoli neuroni in fettine di cervello di luce di eccitazione in epi-fluorescenza, wide-field modalità microscopia utilizzando sia 60X/1.0 Nikon NA o Zeiss 63X/1.0 acqua NA obiettivi immersione. Nostri microscopi sono imbullonati a una tabella d....