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1. Preparazione della fase-shift nanoemulsione (PSNE)
- Sciogliere 11 mg e 1,68 mg DPPC DSPE-PEG2000 in cloroformio
- Si evapora il solvente organico per formare un film secco lipide in un pallone di vetro a fondo rotondo
- Dessicate il film lipidico durante la notte
- Reidratare il film lipidico con 5,5 ml di tampone fosfato salino (PBS)
- Soluzione di calore in un bagno di acqua a 45 ° C fino a quando si scioglie film lipidico, vortex periodicamente
- Trasferire la soluzione lipidica in 7 ml Fiala
- Sonicare soluzione lipidica per 2 min a 20% dell'ampiezza
- Dividere la soluzione in due flaconcini da 2,5 ml (scartare restante 0,5 ml)
- Aggiungere 2,5 ml di soluzione salina in ogni fiala
- Posizionare ciascun flacone con un 0 ° C bagno di acqua ghiacciata
- Aggiungere 50 microlitri DDFP ad ogni flacone
- Sonicare ogni flacone nel bagno di acqua ghiacciata utilizzando le seguenti impostazioni: 25% di ampiezza, modalità pulsata (10 sec a 50 sec spento), 60 secondi sul tempo totale
- Transfer soluzioni PSNE a 20 fiale da scintillazione ml
- Aggiungere 5 ml di soluzione salina in ogni fiala, con conseguente in 10 ml di volume finale
- Montare indicazioni seguenti estrusione forniti dal produttore
- Lavare ogni parte con acqua deionizzata
- Posizionare il disco di supporto in acciaio inox al centro della base di supporto filtro
- Posizionare la maglia di acciaio inossidabile sulla parte superiore del disco di sostegno dell'acciaio inossidabile
- Con una pinzetta, posizionare una membrana di scarico estrusore disco (su lato lucido) sulla rete di acciaio inossidabile
- Con una pinzetta, posizionare il filtro estrusore (il lato lucido) sulla membrana disco di scarico
- Posizionare con cura il piccolo O-ring sul filtro e posizionare il thermobarrel e top estrusore al di sopra della base d'appoggio
- Serrare parzialmente ogni ala-primo dado, quindi serrare a fondo le ali-dadi a mano, in modo alterno
- Collegare l'estrusore auna linea di gas azoto
- Per caricare il, estrusore pipetta da 10 ml di acqua deionizzata alla porta di esempio, chiudere l'apertura, e serrare la valvola di sfiato
- Aprire lentamente la linea di gas azoto per aumentare la pressione, costringendo il campione attraverso le membrane, e raccogliere il campione dal tubo di uscita
- Dopo l'uso, smontaggio in ordine inverso, sciacquare le parti dell'estrusore con acqua deionizzata, e gettare il filtro a membrana e scarico disco membrana
- Per 100 nm goccioline solo, pre-condizione PSNE per estrusione di 10 volte con filtro a 200 nm
- Estrusione PSNE 16 volte in 100 nm o 200 nm di filtro per ottenere una distribuzione ristretta dimensione
2. Preparazione di Hydrogel poliacrilammide contenente PSNE
- Preparare una soluzione al 24% di BSA diluendo 1,2 g BSA polvere in 5 ml di acqua deionizzata
- Preparare la soluzione APS 10% diluito 0,1 g di polvere in 1 ml APS deionizzata water
- Nel seguente ordine, miscelare 2,1 ml di soluzione di acrilammide, 1,2 ml di tampone Tris, 0,1 ml APS 10%, 4,5 ml di soluzione al 24% di BSA e 3,6 ml di acqua deionizzata in camera di plastica
- Riscaldare a 40 ° C e posto sotto vuoto per 1 ora
- Aggiungere 480 ml di PSNE e mescolare bene agitando con delicatezza la camera di plastica.
- Aggiungere 12 microlitri TEMED e posizionare la camera in un bagno di acqua 12 ° C per 2 ore
3. Risultati rappresentativi
Un schematico della configurazione per esperimenti ultrasuoni con tessuti che imitano fantasmi idrogel è mostrato in Figura 1. Questo protocollo risulta in lipidi rivestite goccioline perfluorocarburiche con una distribuzione di dimensione ristretta che sono stabili in soluzione per almeno una settimana. La distribuzione della dimensione misurata con light scattering dinamico (Particle Analyzer 90Plus Size, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) è mostrato in Figura 2 per PSNE estrusi con 100 e 200nm filtri. Il diametro PSNE efficace nel tempo, misurato utilizzando dispersione dinamica della luce, è riportata nella Tabella 1, dimostrando che PSNE sono stabili per almeno una settimana. B-mode immagini di PSNE prima e dopo vaporizzazione in un idrogel di poliacrilamide sono mostrati in Figura 3. Inoltre, una lesione formata da 15 sec di HIFU-mediata riscaldamento in un idrogel di poliacrilamide contenente albumina e PSNE è mostrato in Figura 4. La forma asimmetrica della lesione è il risultato del riscaldamento prefocal che si verifica a causa della presenza della nube bolla nel percorso ultrasuoni. È importante notare che il riscaldamento prefocal e formazione di lesione a causa dispersione da bolle può essere minimizzata riducendo la potenza acustica trasmessa.
Figura 1. Schema del setup sperimentale per ultrasuoni esperimenti con tessuto-mimIcking idrogel.
Figura 2. Dimensione distribuzione di PSNE estruso attraverso 100 nm o 200 nm filtri, misurata con Dynamic Light Scattering. Le unità degli assi delle ordinate sono basati sull'intensità della luce diffusa dalle particelle di una certa dimensione relativa alla intensità totale della luce diffusa dal campione.
Figura 3. Immagini B-mode (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione PSNE in un idrogel di poliacrilamide. La freccia indica la regione focale dove è formata una nube bolla per vaporizzazione PSNE.
Immagini Figura 4. Del polyacrylamide idrogel contenente albumina e PSNE (a) prima e (b) dopo la vaporizzazione e la sonicazione con HIFU, dimostrando formazione di lesione a seguito di ultrasuoni indotta riscaldamento. La frequenza centrale degli ultrasuoni è stata del 3,3 MHz. Il segnale ad ultrasuoni consisteva in un ciclo iniziale di 30, 6,4 W impulsi per vaporizzare PSNE, immediatamente seguito da 15 secondi di ultrasuoni continuo a 0,77 W.
| Giorni dopo estrusione | Estruso con filtro a 200 nm | Estruso con filtro 100 nm |
| Media Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Media Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | 177,7 | 2,5 | 124,8 | 3,1 |
Tabella 1. Diametro medio e la deviazione standard di PSNE a uno e sette giorni dopo l'estrusione con 100 nm e 200 nm filtri.