Tecniche di imaging di recente sviluppate utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) può aiutare a chiarire il ruolo del sistema linfatico gioca in metastasi del cancro, la risposta immunitaria, la riparazione delle ferite, e altre malattie associate linfatico.
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Articolo metodologico
Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema vascolare linfatico è un componente importante del sistema circolatorio che mantiene l'omeostasi fluido, fornisce la sorveglianza immunitaria, e media l'assorbimento di grassi nell'intestino. Eppure, nonostante la sua funzione critica, non vi è la comprensione relativamente poco di come il sistema linfatico si adatta a servire queste funzioni in materia di salute e malattia 1. Recentemente, abbiamo dimostrato la capacità di architettura dinamica linfatica immagine e linfa azione "pompaggio" in soggetti umani normali e anche a persone che soffrono di disfunzione linfatica mediante somministrazione traccia di un vicino infrarosso fluorescente (NIRF) colorante e un costume, Gen III- intensificata sistema di imaging 2-4. NIRF di imaging hanno mostrato cambiamenti drammatici in architettura linfatica e la funzione con la malattia umana. Non è ancora chiaro come questi cambiamenti si verificano e di nuovi modelli animali che sono in fase di sviluppo per chiarire la loro base genetica e molecolare. In questo protocollo, presentiamo linfatico NIRF, small animale Imaging 5,6 utilizzando verde indocianina (ICG), un colorante che è stato usato per 50 anni nell'uomo 7, e un colorante marcato NIRF ciclico dominio di legame (CabD-IRDye800) peptide che si lega preferenzialmente topo e albumina umana 8 . Circa 5,5 volte più luminoso di ICG, 'Abd-IRDye800 ha un profilo simile gioco linfatico e può essere iniettato in piccole dosi di ICG per ottenere segnali NIRF sufficienti per l'imaging 8. Poiché sia bind 'Abd-IRDye800 e ICG all'albumina nello spazio interstiziale 8, entrambi possono descrivere trasporto attivo le proteine in e nei vasi linfatici. Intradermica (ID) iniezioni (microlitri 5-50) di ICG (645 uM) o CabD-IRDye800 (200 pM) in soluzione salina sono somministrati al dorso di ciascuna zampa posteriore e / o il lato sinistro e destro della base del coda di un topo anestetizzato-isoflurano. La concentrazione di colorante conseguente animale è 83-1,250 mcg / kg per ICG o 113-1,700 mg / kg per'Abd-IRDye800. Subito dopo le iniezioni, l'imaging funzionale linfatico è condotto per un massimo di 1 ora con un personalizzato, piccolo sistema animale NIRF imaging. Risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici fluorescenti di 100 micron o meno, e le immagini di strutture fino a 3 cm di profondità possono essere acquisite 9. Le immagini sono acquisite in V + software + e analizzati utilizzando il software ImageJ o MATLAB. Durante l'analisi, consecutivi regioni di interesse (ROI) comprende l'intero diametro nave sono disegnati lungo un vaso linfatico dato. Le dimensioni di ogni ROI sono mantenute costanti per un determinato peschereccio e intensità NIRF è misurato per ciascuna ROI per valutare quantitativamente "pacchetti" di linfa si muove attraverso le navi.
Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme della University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Dipartimento di Medicina comparativa, e Centro di Imaging Molecolare dopo l'esame e l'approvazione del protocollo da parte loro rispettivi Cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) o il benessere degli animali Committee (AWC).
1. Preparazione del 24 Hr Animali Prima di Imaging
La procedura che segue deve essere fatto (se necessario) il giorno prima di imaging linfatico avviene.
- Inserire animale in una scatola di induzione e sedare ....
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Risultati
Esempio di Imaging linfatico NIRF in Mouse
Quando ICG o CabD IRDye800-ID viene iniettato alla base della coda di un topo normale, la vascolarizzazione linfatica tra il sito di iniezione alla base della coda e il linfonodo inguinale (LN) dovrebbe essere immediatamente visualizzata. Poco dopo l'iniezione (pochi secondi o minuti), il vaso linfatico tra la LN inguinale e ascellare LN deve essere visualizzato come visibile in figura 2. Poiché i linfatici nei topi variano da un a.......
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Discussione
Usiamo una consuetudine, piccolo sistema animale NIRF immagini per catturare immagini di vasi linfatici etichettati nei topi. Per costruire film di circolazione linfatico, 300 o più immagini sono raccolte. Per l'analisi funzionale dei vasi linfatici da film, ROI due o più sono disegnata a mano lungo un vaso linfatico. Le dimensioni della ROI sono mantenute costanti per ciascun recipiente e sono approssimativamente il diametro del vaso. Mentre risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici flu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare, ma alcuni autori sono elencati su un brevetto.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da i seguenti aiuti a Eva Sevick: NIH R01 CA128919 e NIH R01 HL092923.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Solutions, reagenti e attrezzature | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Verde indocianina (ICG) | Patheon Italia SPA | NDC 25431-424-02 | Ricostituire a 645 pM (5 μg/10 mL) |
| Ciclico dominio di legame ('Abd) | Bachem | Costume | Ricostituire a 200 pM (6.8 μg/10 mL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Ricostituire secondo le istruzioni del produttore; coniugare con 'Abd a concentrazioni equilmolar |
| Acqua sterile | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co.,Inc. | Negozi locali | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (componenti sotto) | Center for Molecular Imaging | N / A | Custom-costruito nei nostri laboratori. |
| Electron moltiplicatore di Charge-Coupled Device (EMCCD) fotocamera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max. 512 | |
| Nikon obiettivo | Nikon Inc., Melville, NY | Modello n 1992, Nikkor 28 millimetri | |
| Filtro ottico | Andover Corp., Salem, NH | ANDV11333 | Due filtri passa-banda 830.0/10.0 nm vengono utilizzati davanti alla lente |
| 785-nm laser a diodi | Intenso Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW di uscita ottica |
| Ottiche collimanti | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collima uscita laser prima filtro di pulitura |
| Clean-up filtro | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Rimuove emissione laser in banda di fluorescenza |
| Diffusore ottico | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffonde il laser sull'animale |
| V + + | Ottica digitale, Browns Bay, Auckland, Nuova Zelanda | Versione 5.0 | Software utilizzato per controllare il sistema di telecamere e di salvare le immagini al computer. http://digitaloptics.net/ |
| Software analitica Uno dei seguenti pacchetti software può essere utilizzato per l'analisi delle immagini | |||
| ImageJ | Istituto Nazionale dituti di salute, Bethesda, MD | Una versione più aggiornata | Gratuito disponibile a http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Versione 2008a o successiva | http://www.mathworks.com/ |
Riferimenti
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, ....
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Ristampe e permessi
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