Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Sommario

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Abstract

Protocolli esistenti per la generazione di neuroni da cellule staminali pluripotenti (hPSCs) sono spesso noioso in quanto sono procedure multistep coinvolgono l'isolamento e l'espansione di cellule precursori neurali, prima differenziazione terminale. In confronto a questi approcci in termini di tempo, abbiamo recentemente scoperto che l'inibizione combinata di tre vie di segnalazione, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promuove la rapida induzione neuroectoderma da hPSCs, seguita da immediata differenziazione in neuroni funzionali. Qui, abbiamo adattato la nostra procedura per un nuovo formato di piastra multititre, per migliorare ulteriormente la sua riproducibilità e di renderlo compatibile con metà del throughput delle applicazioni. Esso si articola in quattro giorni di formazione neuroectoderma in sfere galleggianti (corpi embrionali), seguito da altri quattro giorni di differenziamento in neuroni in condizioni aderenti. La maggior parte delle cellule ottenute con questo protocollo sembrano essere i neuroni sensoriali bipolari. Inoltre,la procedura è altamente efficiente, non richiede particolari competenze esperte, e si basa su un mezzo chimicamente definito semplice con piccole molecole costo-efficienti. A causa di queste caratteristiche, la procedura può servire come piattaforma utile per un'ulteriore indagine funzionale così come per la cella di screening avvicina richiedendo umani neuroni sensoriali o neuroni di qualsiasi tipo.

Introduzione

hPSCs, composto da embrioni derivati ​​da cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono pluripotenti significato che possono dare origine a diverse linee cellulari in vitro ^1-2. Numerosi tipi di cellule differenziate sono stati derivati ​​da hESC ad oggi, sostenendo l'idea che queste cellule presentano strumenti utili per la ricerca scientifica e basati su celle approcci di screening, e promettenti per terapie a base di cellule.

Protocolli per la differenziazione neuronale hESC sono solitamente complesse e lunghe quanto sono spesso basati sulla prima sorte indurre....

Protocollo

1. Preparazione di Matrigel piastre rivestite e Media

1. Preparazione di Matrigel piastre rivestite Matrigel è stato trovato per essere un substrato preferito per il fissaggio di differenziare EBs e promuove anche la conseguenza efficiente di questi neuroni di ^10.
   1. Scongelare 10 ml di una notte sul ghiaccio Matrigel.
   2. Il giorno dopo, diluire il gelatinosa Matrigel con due volumi di ghiaccio-freddo DMEM/F-12 e preparare aliquote di 1 ml in prechilled provette da 15 ml coniche che possono essere conservati congelati a -20 ° C.
   3. Decidere su un formato di piastra per la differenziazione neuronale. Per esempio, come punto di pa....

Risultati

Nella nostra precedente relazione, in linea con molti altri, EBs da hPSCs potrebbe essere generato semplicemente replating aggregati al momento scissione di routine di hPSCs in basso attaccamento piatti ^10. Questo di solito si traduce in una distribuzione gamma di formati EB risultanti (Figura 1C, in alto). Un altro problema derivante da questo è che EBs mantenute in sospensione tendono ad aggregarsi tra loro, portando ad una eterogeneità ancora maggiore di dimensioni EB. Per aggirare questi .......

Discussione

Maggior parte dei protocolli di differenziazione che comportano la formazione di EB da hPSCs, compresa la nostra procedura precedentemente pubblicato con il ^10, sono basati su manuale o enzima-assistita raccolta di hESC come aggregati, il che porta inevitabilmente a eterogeneità nei formati EB. Questo fatto porta a variabilità in efficienza differenziazione con alcune linee cellulari, rendendo così difficile analisi sistema, in particolare su scala velocità media. Inoltre, la dissezione manuale è alta intensi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Vedere il testo per ulteriori dettagli sulla gestione
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poli (vinil alcool)	Sigma	363170	Sciogliere al 0,4% in DMEM/F-12 utilizzando un bagno d'acqua ad ultrasuoni / evitare il surriscaldamento / può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane
N2 Supplemento	Life Technologies	17502-048	100X, memorizzare come aliquote congelate
B27 Supplemento	Life Technologies	12587-010	50X, negozio come aliquote congelate
Albumina di siero bovino	Sigma	A1595	10% = 500X, negozio come aliquote congelate
L-Glutammina con penicillina / streptomicina	PAA	P11-013	O equivalente
FGF2	Peprotech	100-18B	Sciogliere a 10 pg / ml in 0,1% di BSA / PBS = 1000X, negozio come aliquote congelate
ROCK inibitore Y-27.632	abcamBiochemicals	Asc-129	Sciogliere a 10 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
PBS	PAA	H15-002	O equivalente
Accutase	PAA	L11-007
Da 96 pozzetti con fondo a V piastre	Nunc	277143
PD0325901	Axon medchem	Axon 1408	Sciogliere a 0.5 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	sciogliere a 15 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	sciogliere a 0.5 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
96 pozzetti U-basso ultra-low di fissaggio piastre	Corning	7007
beta-III anticorpo Tubulin (mouse)	Sigma	T8660	utilizzare a 1:1000
beta-III tubulina (coniglio)	Covance	PRB-435P	utilizzare a 1:2000
BRN3A (POU4F1) anticorpo	Santa Cruz	sc-8429	utilizzare a 1:500
			Tabella 1. </ Strong> reagenti e attrezzature specifiche.