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hPSCs, composto da embrioni derivati da cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono pluripotenti significato che possono dare origine a diverse linee cellulari in vitro 1-2. Numerosi tipi di cellule differenziate sono stati derivati da hESC ad oggi, sostenendo l'idea che queste cellule presentano strumenti utili per la ricerca scientifica e basati su celle approcci di screening, e promettenti per terapie a base di cellule.
Protocolli per la differenziazione neuronale hESC sono solitamente complesse e lunghe quanto sono spesso basati sulla prima sorte indurre complessiva neurale, seguito da isolamento manuale dei progenitori neurali, e la differenziazione terminale successiva in un determinato tipo di neurone di interesse 3-6. In alcuni riguardo, questa complessità non è sorprendente e inevitabile dato che un tale state-of-the-art protocolli di differenziazione diretti tendono a imitare graduale primi stadi dello sviluppo umano, which è di per sé estremamente complesso. D'altra parte, può in parte anche riflettere la nostra mancanza di comprensione dei processi molecolari sottostanti, con conseguente protocolli di differenziazione che sono ancora lungi dall'essere completamente ottimizzato.
Per quanto riguarda la conversione di hPSCs indifferenziate in neuroectoderma, Pera et al. trovato che la soppressione di BMP / SMAD1/5/8 segnalazione aumenta l'induzione neurale del hESC 7. Inoltre, l'inattivazione di SMAD2 / 3 segnalazione ha dimostrato di promuovere la formazione neuroectoderma 8. Di conseguenza, l'inattivazione combinata di queste due vie tende a generare una più efficace di induzione neurale del hPSCs 4,9. Più di recente, abbiamo dimostrato che un percorso di segnalazione terzo, FGF / ERK, funge da repressore forte delle prime fasi di impegno neuroectodermica in hESC. Al contrario, la repressione simultanea di tutti e tre questi percorsi portare a quasi omogenea conversione di hESC in neuroectoderma conin soli quattro giorni 10. Successivamente, la differenziazione terminale altamente efficiente in neuroni funzionali è stato osservato entro otto giorni. I neuroni ottenuti sono stati probabilmente i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico, che può in parte spiegare la loro derivazione rapida 10. Difetti nella manutenzione neurone sensoriale è considerata una causa di alcune patologie umane come disautonomia familiare 11. Per la modellazione di tali malattie basato su tecnologia hiPSC 12, per un'ulteriore caratterizzazione funzionale, nonché per scopi applicati non richiedono alcun tipo particolare di neuroni, questa procedura differenziazione può presentare una base utile.
Tuttavia, la strategia di differenziazione che avevamo originariamente impiegato coinvolto formazione di corpi embrionali (EB) da ciuffi di colonie hESC 10, e ciò ha determinato un bel grado di eterogeneità per quanto riguarda formati EB, e apparso anche di compromettere l'efficienza formazione dei neuroni in alcune ceLinee ll. Inoltre, a causa della eterogeneità in dimensioni EB, la possibilità di verificare sistematicamente effetti dei fattori di crescita addizionali o piccole molecole durante e dopo la formazione dei neuroni sembravano essere alquanto confuso.
In questo rapporto, abbiamo adattato la nostra procedura precedente per un rendimento medio-compatibile, l'aggregazione forzata a base di tecnica per generare EBs in una dimensione altamente controllato modo, come mostrato anche in altri contesti 13. Successivamente, l'EBS generato in forma di V pozzetti di piastre da 96 pozzetti sono state trasferite a forma di U bassissimo attaccamento piastre da 96 pozzetti, per avviare la formazione neuroectoderma in sospensione. Quattro giorni più tardi, l'EBS potrebbe essere piastrate dando origine a neuroni terminalmente differenziate ad alta efficienza e omogeneità. In alternativa, giorno-4 EBs erano dissociate in singole cellule e placcato in quanto tale, che ha portato a bassa densità monostrati di neuroni umani. Risultati coerenti sono stati finora ottenuti con due indipendentemente delinee di hESC rived, HuES6 e NCl3.
Come prerequisito, formazione EB successo era strettamente dipendente l'uso di un polimero sintetico, alcool polivinilico (PVA), insieme con inibitore ROCK Y-27.632 noto per promuovere la sopravvivenza hESC 13-14. Come risultato, l'omogeneità del EBs formata in 96-V-piastre è stata notevolmente migliorata rispetto a formazione di EBS come culture di massa basato su metodi di frazionamento casuali. Questo sistema fornisce quindi una piattaforma significativamente migliorato per la formazione neuroectoderma in coltura in sospensione, seguito dalla formazione neurone altamente controllato in condizioni aderenti.