Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Sommario

Qui, presentiamo un metodo per l'interruttore fotoattivato di proteine fluorescenti fotoconvertibili (PCFP) nell'embrione vivente di pesce zebra e un ulteriore monitoraggio della proteina fotoconvertita in punti temporali specifici durante lo sviluppo. Questa metodologia consente il monitoraggio degli eventi biologici cellulari alla base di diversi processi di sviluppo in un organismo vertebrato vivo.

Abstract

L'embriogenesi è un processo dinamico che viene studiato al meglio utilizzando tecniche che consentono la documentazione dei cambiamenti dello sviluppo in vivo. L'uso di proteine fluorescenti geneticamente codificate si è dimostrato una strategia preziosa per chiarire i processi morfogenetici dinamici che si verificano nell'organismo intatto. Durante l'ultimo decennio, lo sviluppo di proteine fluorescenti fotoattivabili e fotoconvertibili ha aperto la possibilità di studiare il destino di sottopopolazioni discrete di proteine marcate¹. A differenza delle proteine fotoattivabili, le proteine fluorescenti fotoconvertibili (PCFP) sono facilmente tracciabili e visualizzate nel loro stato di emissione nativo prima della fotoconversione, facilitando l'identificazione e la selezione delle regioni mediante ispezione ottica. I PCFP, come Kaede², KikGR³, Dendra⁴ e EosFP⁵, possono essere spostati dal verde al rosso dopo l'esposizione ai raggi UV o alla luce blu a causa di una sequenza di tripeptide His-Tyr-Gly che forma un cromoforo verde che può essere fotoconvertito in uno rosso mediante una β-eliminazione catalizzata dalla luce e la successiva estensione di un sistema π-coniugato³. I PCFP e le loro varianti monomeriche sono strumenti utili per tracciare le cellule^6-10 e studiare la dinamica delle proteine^11-14, rispettivamente. Negli ultimi anni, i PCFP sono stati espressi in diversi modelli animali, come il pesce zebra⁶, il pollo^7,8 e il topo^9,10 per il monitoraggio del destino cellulare. Qui riportiamo un protocollo per la fotoconversione cellulo-specifica di PCFP nell'embrione vivente di zebrafish e un ulteriore monitoraggio delle proteine fotoconvertite nelle fasi successive dello sviluppo. Questa metodologia consente di studiare, in modo tessuto-specifico, gli eventi biologici cellulari alla base della morfogenesi nel modello animale di zebrafish.

Protocollo

1. Ottenere embrioni per il test di fotoconversione

Dopo l'incrocio di zebrafish transgenico che esprime un PCFP, vengono scelti gli embrioni omozigoti più brillanti e cresciuti a 28,5 °C fino allo stadio embrionale desiderato¹⁵.

Nota 1: Questa preselezione consentirà di scansionare embrioni con bassa potenza laser, prevenendo così la fototossicità e il fotosbiancamento.

Nota 2: Suggeriamo di utilizzare una luce a bassa intensità quando si visualizzano gli embrioni e di mantenerli in condizioni di oscurità a causa dell'elevata sensibilità dei PCFP, come Kaede e KikGR, all'espo....

Discussione

Negli ultimi anni sono stati generati modelli animali transgenici per l'espressione di proteine fotoconvertibili come Kaede o KikGR. Questi animali si sviluppano normalmente, indicando che queste proteine non hanno effetti tossici sullo sviluppo embrionale. Il primo rapporto su un saggio di fotoconversione per il tracciamento delle cellule in embrioni animali è stato eseguito da Hatta e collaboratori mediante iniezione di mRNA o DNA che codifica Kaede in embrioni di zebrafish unicellulari per l'espressione ubiquitaria, o.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali:
Attrezzatura necessaria per l'allevamento dei pesci e la raccolta delle uova (vedi il Zebrafish Book22 per i dettagli).
Stereomicroscopio	Leica	Lecia MZ6 Stereomicroscopio	Dotato di laser operante a 488 nm
Microscopio a scansione laser confocale	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	dotato di laser operanti a 488 nm, 561 nm e 405 nm
Blocco
Coppia di pinze
Piatto di coltura con fondo di vetro	MatTek Corp		Punte
per pipette per microloader	Aghi Eppendorf
Vortex
Reagenti:
Acqua d'uovo media
60 μ g/ml Sali marini oceanici istantanei in ddH2O
E3 medium
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO4
0.00001% (p/v) Blu di metilene
4 mg/ml Soluzione madre di tricaina
400 mg Tricaina (3-amminoacido benzoicoetilestere)	Sigma-Aldrich
97.9 ml ddH2O
2.1 ml 1M Tris (pH9)
Regolare a pH 7, aliquotare e conservare -20 ° C
1% LMA (Agarosio a bassa temperatura di fusione, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 medium 1X
Aliquot e conservare a 4 ° E