In questo studio, presentiamo un metodo per l'attivazione mediante luce di proteine fluorescenti fotoconvertibili (PCFPs) nell'embrione di pesce zebra vivente e il successivo tracciamento della proteina fotoconvertita in specifici punti temporali durante lo sviluppo. Questa metodologia consente il monitoraggio di eventi di biologia cellulare alla base di diversi processi di sviluppo in un organismo vertebrale vivente.
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Articolo metodologico
Cella di rilevamento utilizzando proteine Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'embriogenesi è un processo dinamico che si studia al meglio mediante tecniche che consentono la documentazione dei cambiamenti nello sviluppo in vivo. L'uso di proteine fluorescenti codificate geneticamente si è rivelato una strategia preziosa per chiarire i processi morfogenetici dinamici mentre avvengono nell'organismo integro. Negli ultimi dieci anni, lo sviluppo di proteine fluorescenti fotoattivabili e fotoconvertibili ha aperto la possibilità di indagare il destino di sottopopolazioni discrete di proteine marcate1. A differenza delle proteine fotoattivabili, le proteine fluorescenti fotoconvertibili (PCFP) possono essere facilmente seguite e immaginate nel loro stato di emissione nativo prima della fotoconversione, rendendo più semplice identificare e selezionare le regioni mediante ispezione ottica. Le PCFP, come Kaede2, KikGR3, Dendra4 ed EosFP5, possono passare dal verde al rosso dopo esposizione alla luce UV o blu grazie a una sequenza tripeptidica His-Tyr-Gly che forma un cromoforo verde convertibile in rosso mediante una β-eliminazione catalizzata dalla luce e un conseguente allungamento di un sistema π-coniugato3. Le PCFP e le loro varianti monomeriche sono strumenti utili rispettivamente per il tracciamento delle cellule6-10 e lo studio della dinamica proteica11-14. Negli ultimi anni, le PCFP sono state espresse in diversi modelli animali, come il pesce zebra6, il pollo7,8 e il topo9,10, per il tracciamento del destino cellulare. Qui riportiamo un protocollo per la fotoconversione cellulare specifica delle PCFP nell'embrione di pesce zebra vivo e il successivo tracciamento delle proteine fotoconvertite in stadi di sviluppo successivi. Questa metodologia consente di studiare, in maniera specifica per tessuto, gli eventi biologici cellulari alla base della morfogenesi nel modello animale del pesce zebra.
Protocollo
1. Ottenimento di embrioni per il saggio di fotoconversione
Dopo l'incrocio tra zebrafish transgenici che esprimono un PCFP, vengono selezionati gli embrioni omozigoti più luminosi e allevati a 28,5 °C fino allo stadio embrionale desiderato15.
Nota 1: Questa preselezione permetterà di scansionare gli embrioni con una bassa potenza laser, evitando così fototossicità e fotodegradazione.
Nota 2: Si consiglia di utilizzare una luce a bassa intensità durante la visualizzazione degli embrioni e di mantenerli al buio a causa dell'elevata sensibilità dei PCFP, come Kaede e KikGR, all'esposizione alla luce, compresa la luce naturale.
2. Inclusione
- In un contenitore di vetro con acqua per uova, dechorionare gli embrioni sotto un microscopio stereoscopico utilizzando pinzette.
- Anestetizzare gli embrioni trasferendo un embrione dechorionato in una soluzione di Tricaine 0,16 mg/ml (etil estere dell'acido 3-amminobenzoico, Sigma-Aldrich) (40μl di soluzione madre 4 mg/ml in 1 ml di mezzo E3 1X).
Nota 1: Trasferire gli embrioni con una pipetta di vetro o con una punta tagliata (P1000) per minimizzare il rischio di danneggiare gli embrioni.
Nota 2: Gli embrioni giovani dechorionati non devono essere esposti all'aria né sollevati fino all'interfaccia acqua/aria, poiché le uova si rompono facilmente quando sottoposte a stress meccanico.
- Trasferire l'embrione anestetizzato sul coperchio di una piastra per colture e mantenere l'embrione nel volume minimo possibile di mezzo.
- Trasferire l'embrione nell'agarosio prelevandolo con agarosio al 1% a bassa temperatura di fusione (LMA, Lonza) a 30 °C contenente 0,16 mg/ml di Tricaine, e posizionarlo sul vetrino di una piastra per colture con fondo in vetrino (MatTek Corp. Ashland MA USA). Successivamente, orientare l'embrione con l'aiuto di una punta di plastica liscia (e.g. una punta di pipetta Microloader tagliata, Eppendorf) e, una volta che l'LMA si è polimerizzato, ricoprire l'agarosio con soluzione di Tricaine 0,16 mg/ml.
Nota 1: Sciogliere l'1% di LMA a 60 °C e mantenere l'agarosio fuso a 30 °C.
3. Fotoconversione
- Utilizzando un microscopio confocale invertito dotato di sorgenti laser a 405 nm, 488 nm e 561 nm, come ad esempio il Zeiss LSM 710, visualizzare il campione mediante una scansione in z-Stack che copra l'intera struttura del campione da fotoconvertire e successivamente tracciare, usando il laser a 488 nm (i.e., laser Ar da 30 mW, all'intensità del 5-7%, rivelatore impostato su 493-540 nm) e il laser a 561 nm (i.e., laser DPSS 561 da 10 mW, all'intensità del 7-9%, rivelatore impostato su 587-651 nm) per scansionare il tessuto/organo rispettivamente per la fluorescenza verde e rossa delle proteine fotoconvertibili.
Nota 1: Per la scansione prima della fotoconversione, abbiamo utilizzato un obiettivo Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Nota 2: eseguire sempre una scansione per la fluorescenza rossa prima dell'esperimento per escludere la presenza di PCFP rosso convertito accidentalmente.
- Selezionare lo strumento Time series e impostare 2 cicli senza intervallo (uno per il pre- e uno per il post-fotoconversione).
- Selezionare lo strumento Regions e definire una o più regioni di interesse (ROI) per la fotoconversione.
Nota 1: Si raccomanda di determinare innanzitutto la precisione con cui la regione effettivamente fotoconvertita dal laser di scansione nell'area di interesse (ROI) corrisponde all'ROI selezionata nel software, misurando l'area del tessuto o delle cellule fotoconvertite in tutte e tre le direzioni (xy e z) in un campione fissato in cui non ci si aspetta movimento cellulare o proteico. Per le impostazioni descritte in questa applicazione, l'ROI corrispondeva alla regione fotoconvertita con grande precisione, ma ciò dipende dall'obiettivo utilizzato e dalla quantità di laser applicata per la fotoconversione. Le dimensioni dell'ROI possono essere ridotte fino alle dimensioni di una singola cellula, a seconda dell'apertura numerica dell'obiettivo, del fattore di ingrandimento e della quantità di luce laser impiegata per la fotoconversione.
- Selezionare lo strumento Bleaching e impostare l'inizio del bleaching dopo la scansione 1 di 2. Abbiamo utilizzato un laser a diodo da 30 mW a 405 nm per la fotoconversione, ottimizzando attentamente la quantità minima di luce laser necessaria per una fotoconversione completa, il che viene principalmente ottenuto variando l'intensità della luce laser, il numero di scansioni della regione di interesse (ROI) e il tempo per pixel (ovvero, la velocità di scansione).
Nota 1: Per la fotoconversione abbiamo utilizzato un obiettivo Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Nota 2: La potenza del laser e il numero di iterazioni devono essere determinati empiricamente per ogni condizione sperimentale e devono garantire la fotoconversione completa da PCFP verde a rosso all'interno dell'area di interesse (ROI) con la minima quantità necessaria di luce laser per ridurre la fototossicità. Si raccomanda di iniziare i test utilizzando una bassa potenza del laser (ad es. 3 %, corrispondente a 0,03 mW nel piano dell'obiettivo) combinata con un basso numero di iterazioni (ad es. 20), aumentando successivamente la potenza del laser fino a raggiungere una fotoconversione completa, che nel nostro caso si è verificata a una potenza del 10% (corrispondente a 0,1 mW nel piano dell'obiettivo). In queste condizioni, tutti gli embrioni testati hanno sopravvissuto al protocollo di trattamento. Tuttavia, abbiamo osservato che la membrana del tuorlo è sensibile agli impulsi laser e può essere facilmente danneggiata, causando la morte dell'embrione. Per questo motivo, la letalità embrionale dopo la fotoconversione può verificarsi se la posizione del tessuto bersaglio è vicina al corpo del tuorlo.
- Scansionare il campione mediante uno z-Stack utilizzando laser a 488 nm e 561 nm per visualizzare la fluorescenza verde residua e quella rossa fotoconvertita del PCFP.
Nota 1: Per la scansione dopo la fotoconversione, abbiamo utilizzato un Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
4. Rimuovere l'embrione dall'agarosio
- Scartare la soluzione ed estrarre con attenzione l'embrione dal LMA al 1% con l'aiuto di un ago o di una punta di plastica liscia.
- Mantenere l'embrione in acqua per uova al buio a 28,5 °C fino allo stadio di sviluppo desiderato.
Nota 1: È importante che gli embrioni proseguano il loro sviluppo nell'acqua per uova, in particolare durante i primi giorni di sviluppo, quando avviene l'allungamento del corpo embrionale. Infatti, alcuni tessuti/organismi embrionali cambiano posizione durante lo sviluppo e richiedono quindi orientamenti specifici durante l'inclusione, che dipendono dal particolare tessuto/organo di interesse e dallo stadio di sviluppo desiderato per l'analisi.
5. Ri-inclusione
- Procedere come al punto 2.) del presente protocollo.
6. Monitoraggio del tessuto fotoconvertito in stadi embrionali successivi
- Acquisizione dell'area di interesse (z-Stack) mediante l'utilizzo di laser a 488 nm e 561 nm per i segnali fluorescenti verde e rosso, rispettivamente.
Nota 1: Per la scansione a x ore dalla fotoconversione, abbiamo utilizzato un Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Nota 2: poiché questo protocollo non influenza lo sviluppo normale dell'embrione, è possibile osservare l'embrione fotoconvertito in stadi successivi dello sviluppo (a tale scopo, procedere come indicato ai punti 4 - 6).
7. Risultati Rappresentativi
Un esempio di saggio di fotoconversione è mostrato in Figura 1. Abbiamo seguito le cellule endoteliali durante lo sviluppo del pesce zebra (per una revisione dell'anatomia vascolare del pesce zebra in via di sviluppo si veda16). Di conseguenza, abbiamo utilizzato una linea reporter di pesce zebra Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 che esprime KikGR all'interno dei nuclei endoteliali17. Gli embrioni omozigoti e fortemente espressivi sono stati allevati a 28,5 °C fino a 48 ore dopo la fecondazione (hpf). Dopo la dechorionazione, gli embrioni sono stati anestetizzati e inclusi nell'LMA posizionando il lato anteriore-dorsale dell'embrione verso il coprioggetto per una migliore visualizzazione dei vasi della testa. Abbiamo utilizzato un microscopio confocale invertito (Zeiss LSM 710 Meta) dotato di laser operanti a 405 nm, 488 nm e 561 nm, e un obiettivo Plan Apochromat 20x/NA 0,8 per il saggio di fotoconversione e il successivo monitoraggio della proteina fotoconvertita. Come mostrato in Figura 1A, prima della fotoconversione, KikGR era espresso all'interno del tessuto endoteliale ed era rilevabile solo come fluorescenza verde utilizzando un laser Argon a 488 nm. Scansioni di controllo con un laser DPSS 561-10 a 561 nm per la fluorescenza rossa non hanno rilevato alcun KikGR fotoconvertito prima della fotoconversione (Figura 1A). Successivamente, la regione di interesse (ROI) è stata completamente fotoconvertita utilizzando un laser a diodo a 405 nm (all'intensità del 10%, 20 iterazioni) e i vasi della testa sono stati scansionati nuovamente utilizzando i laser a 488 nm e 561 nm (Figura 1B). Come mostrato in Figura 1B, la fluorescenza verde di KikGR si era completamente trasformata in rossa all'interno della ROI. Dopo il saggio di fotoconversione, l'embrione è stato rimosso dall'agarosio ed allevato a 28,5 °C in acqua per uova. Infine, l'embrione è stato osservato nuovamente 24 ore dopo la fotoconversione, circa a 72 hpf, per seguire le cellule endoteliali fotoconvertite in stadi successivi (Figura 1C). Pertanto, l'embrione è stato nuovamente incluso nell'LMA e il campione è stato riscansionato utilizzando i laser a 488 nm e 561 nm. Come mostrato in Figura 1C, all'interno del tessuto endoteliale derivante dalla ROI fotoconvertita, sono state osservate sia proteine KikGR non fotoconvertite che fotoconvertite, a causa della stabilità della forma fotoconvertita di KikGR fluorescente rossa e della risintesi di nuova KikGR verde non fotoconvertita.
Figura 1. Fotoconversione della KikGR durante lo sviluppo del pesce zebra. (A,B) Una regione specifica della vascolarizzazione endoteliale della testa è stata fotoconvertita a 48 hpf in embrioni transgenici Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 e (C) osservata nuovamente 24 ore dopo la fotoconversione (circa 72 hpf). Sono mostrate la fluorescenza della KikGR (verde), della KikGR fotoconvertita (rossa) e dei canali sovrapposti. Cerchi tratteggiati indicano la regione di interesse (ROI) prima, dopo e 24 ore dopo la fotoconversione. Le immagini sono viste dorsali dell’embrione di pesce zebra, con l’estremità anteriore in basso. Barre della scala: 50 μm.
| Proteina (Acronimo) | Ex (nm) | Em (nm) | EC | QY | Struttura quaternaria | Luminosità | Applicazione | Rif |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | tetramero | 259 | Tracciamento cellulare | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | tetramero | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | tetramero | 112 | Tracciamento cellulare | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | tetramero | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | monomero | 101 | Tracciamento dinamico Immagini di super-risoluzione | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | monomero | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | tetramero | 150 | Tracciamento cellulare | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | tetramero | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | dimeri tandem | 165 | Immagini di super-risoluzione | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | dimeri tandem | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | monomero | 140 | Tracciamento dinamico Immagini di super-risoluzione | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | monomero | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | monomero | 67 | Tracciamento dinamico Immagini di super-risoluzione | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | monomero | 57 |
Tabella I. Proprietà delle proteine fluorescenti fotoconvertibili. Nella tabella sono riportati, per ciascuna PCFP, il nome comune e/o acronimo, le lunghezze d'onda di eccitazione (Ex) ed emissione (Em) di picco, i coefficienti di estinzione molare (EC, 10-3 M-1 cm-1), il rendimento quantico (QY), la struttura quaternaria fisiologicamente rilevante, la luminosità relativa (in percentuale rispetto a EGFP), l'applicazione e i riferimenti bibliografici. Tabella adattata da Day e Davidson, 20101.
| PCFP | Linee transgeniche di zebrafish | Fonte |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | Okamoto Lab |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | Higashijima Lab | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
Tabella II. Linee transgeniche di zebrafish che esprimono PCFPs. Dati ottenuti nel Zebrafish Model Organism Database (ZFIN, http://zfin.org/). È indicata la disponibilità delle linee presso il Zebrafish International Resource Center (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/).
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Discussione
Negli ultimi anni sono stati generati modelli animali transgenici per l'espressione di proteine fotoconvertibili come Kaede o KikGR. Questi animali si sviluppano normalmente, indicando che tali proteine non hanno effetti tossici sullo sviluppo embrionale. La prima descrizione di un saggio di fotoconversione per il tracciamento cellulare negli embrioni animali è stata effettuata da Hatta e collaboratori, mediante iniezione di mRNA o DNA codificante Kaede in embrioni di pesce zebra a un solo nucleo per un'espressione ubiqu...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Ian C. Scott per aver gentilmente fornito la linea transgenica di pesce zebra Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 presso l'Ospedale per Bambini Malati di Toronto, in Canada. Ringraziamo la Struttura Centrale di Microscopia Confocale e a Due Fotoni (Centro Max-Delbrueck per la Medicina Molecolare) e il dottor Zoltan Cseresnyes per l'eccellente assistenza tecnica e il supporto complessivo nell'imaging. S.A.-S. beneficia di una borsa di studio Heisenberg della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento DFG SE2016/7-1.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali: | |||
| Attrezzatura necessaria per l'allevamento dei pesci e il prelievo delle uova (per dettagli, consultare il Zebrafish Book22). | |||
| Stereo microscopio | Leica | Leica MZ6 Stereo microscopio | Dotato di laser operante a 488 nm |
| Microscopio confocale a scansione laser | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | Dotato di laser operanti a 488 nm, 561 nm e 405 nm |
| Blocco riscaldante | |||
| Pinzette Dumont n. 5 | |||
| Piatto colturale con fondo in vetrino | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| Punte per pipetta Microloader | Eppendorf | ||
| Vortex | |||
| Aghi | |||
| Reagenti: | |||
| Mezzo acqua-uova | |||
| 60 μg/ml di sali marini Instant Ocean in ddH2O | |||
| Mezzo E3 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0,17 mM KCl | |||
| 0,33 mM CaCl2 | |||
| 0,33 mM MgSO4 | |||
| 0,00001% (p/v) Blu di metilene | |||
| Soluzione madre di Tricaina 4 mg/ml | |||
| 400 mg di Tricaina (etil estere dell'acido 3-amminobenzoico) | Sigma-Aldrich | ||
| 97,9 ml di ddH2O | |||
| 2,1 ml di Tris 1 M (pH 9) | |||
| Regolare a pH 7, aliquotare e conservare a -20 °C | |||
| Agarosio a bassa temperatura di fusione (LMA, Lonza) al 1% | |||
| 1 g di LMA/100 ml di mezzo E3 1X | |||
| Aliquotare e conservare a 4 °C |
Riferimenti
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- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
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