Articolo metodologico

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

DOI:

10.3791/4350

⸱

28 settembre 2012

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un metodo per l'interruttore fotoattivato di proteine fluorescenti fotoconvertibili (PCFP) nell'embrione vivente di pesce zebra e un ulteriore monitoraggio della proteina fotoconvertita in punti temporali specifici durante lo sviluppo. Questa metodologia consente il monitoraggio degli eventi biologici cellulari alla base di diversi processi di sviluppo in un organismo vertebrato vivo.

Abstract

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L'embriogenesi è un processo dinamico che viene studiato al meglio utilizzando tecniche che consentono la documentazione dei cambiamenti dello sviluppo in vivo. L'uso di proteine fluorescenti geneticamente codificate si è dimostrato una strategia preziosa per chiarire i processi morfogenetici dinamici che si verificano nell'organismo intatto. Durante l'ultimo decennio, lo sviluppo di proteine fluorescenti fotoattivabili e fotoconvertibili ha aperto la possibilità di studiare il destino di sottopopolazioni discrete di proteine marcate1. A differenza delle proteine fotoattivabili, le proteine fluorescenti fotoconvertibili (PCFP) sono facilmente tracciabili e visualizzate nel loro stato di emissione nativo prima della fotoconversione, facilitando l'identificazione e la selezione delle regioni mediante ispezione ottica. I PCFP, come Kaede2, KikGR3, Dendra4 e EosFP5, possono essere spostati dal verde al rosso dopo l'esposizione ai raggi UV o alla luce blu a causa di una sequenza di tripeptide His-Tyr-Gly che forma un cromoforo verde che può essere fotoconvertito in uno rosso mediante una β-eliminazione catalizzata dalla luce e la successiva estensione di un sistema π-coniugato3. I PCFP e le loro varianti monomeriche sono strumenti utili per tracciare le cellule6-10 e studiare la dinamica delle proteine11-14, rispettivamente. Negli ultimi anni, i PCFP sono stati espressi in diversi modelli animali, come il pesce zebra6, il pollo7,8 e il topo9,10 per il monitoraggio del destino cellulare. Qui riportiamo un protocollo per la fotoconversione cellulo-specifica di PCFP nell'embrione vivente di zebrafish e un ulteriore monitoraggio delle proteine fotoconvertite nelle fasi successive dello sviluppo. Questa metodologia consente di studiare, in modo tessuto-specifico, gli eventi biologici cellulari alla base della morfogenesi nel modello animale di zebrafish.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ottenere embrioni per il test di fotoconversione

Dopo l'incrocio di zebrafish transgenico che esprime un PCFP, vengono scelti gli embrioni omozigoti più brillanti e cresciuti a 28,5 °C fino allo stadio embrionale desiderato15.

Nota 1: Questa preselezione consentirà di scansionare embrioni con bassa potenza laser, prevenendo così la fototossicità e il fotosbiancamento.

Nota 2: Suggeriamo di utilizzare una luce a bassa intensità quando si visualizzano gli embrioni e di mantenerli in condizioni di oscurità a causa dell'elevata sensibilità dei PCFP, come Kaede e KikGR, all'esposizione alla luce, compresa la luce diurna.

2. Incorporamento

  1. In un contenitore di vetro con acqua d'uovo, dechorionato gli embrioni al microscopio stereoscopico utilizzando una pinza.
  2. Anestetizzare gli embrioni trasferendo un embrione dechorionato in una soluzione 0,16 mg/ml di tricaina (3-amminobenzoico acido benzoico, estere etilico, Sigma-Aldrich) (40 μl di soluzione madre 4 mg/ml in 1 ml di terreno E3 1X).

Nota 1: Trasferisci gli embrioni con una pipetta di vetro o una punta tagliata (P1000) per ridurre al minimo il rischio di danneggiare gli embrioni.

Nota 2: I giovani embrioni decorionati non devono essere esposti all'aria o sollevati fino all'interfaccia acqua/aria, poiché gli ovuli si rompono facilmente se sottoposti a stress meccanico.

  1. Trasferire l'embrione anestetizzato sul coperchio di una piastra di coltura e mantenere l'embrione entro il volume più piccolo possibile di terreno.
  2. Trasferire l'embrione nell'agarosio pipettandolo con agarosio all'1% a bassa temperatura di fusione (LMA, Lonza) a 30 °C contenente 0,16 mg/ml di tricaina e posizionarlo sul vetro di copertura di una capsula di coltura con fondo di vetro di copertura (MatTek Corp., Ashland, MA, USA). Successivamente, orientare l'embrione con l'aiuto di una punta di plastica liscia (ad es. una punta per pipette Microloader tagliata, Eppendorf) e, quando l'LMA si è polimerizzato, coprire l'agarosio con una soluzione di tricaina 0,16 mg/ml.

Nota 1: Fondere l'1% di LMA a 60 °C e mantenere l'agarosio fuso a 30 °C.

3. Fotoconversione

  1. Su un microscopio confocale invertito dotato di una sorgente laser da 405 nm, 488 nm e 561 nm, come lo Zeiss LSM 710, è possibile visualizzare il campione mediante una scansione z-Stack che copre l'intera struttura del campione da fotoconvertire e tracciare successivamente utilizzando il laser a 488 nm (cioè un laser Ar da 30 mW, a un'intensità del 5-7 %, un rivelatore impostato a 493-540 nm) e il laser a 561 nm (ad es., laser DPSS 561 da 10 mW, al 7-9 % di intensità, rivelatore impostato su 587-651) per scansionare il tessuto/organo alla ricerca della fluorescenza verde e rossa delle proteine fotoconvertibili, rispettivamente.

Nota 1: Per la scansione prima della fotoconversione, abbiamo utilizzato un obiettivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Nota 2: Scansiona sempre la fluorescenza rossa prima dell'esperimento per escludere che sia presente qualsiasi PCFP convertito in rosso generato accidentalmente.

  1. Selezionare lo strumento Serie temporali e impostare per 2 cicli senza intervallo (uno per la pre e uno per la post fotoconversione).
  2. Seleziona lo strumento Regioni e definisci una o più regioni di interesse (ROI) per la fotoconversione.

Nota 1: Raccomandiamo di determinare prima la precisione con cui la regione effettivamente foto-convertita dal laser di scansione nella ROI corrisponde alla ROI selezionata nel software misurando l'area di tessuto/cellule fotoconvertite in tutte e tre (direzione xy e z) in un campione fisso dove non è previsto alcun movimento di cellule o proteine. Per le impostazioni descritte in questa applicazione, il ROI corrispondeva alla regione fotoconvertita con grande precisione, ma questo dipende dall'obiettivo utilizzato e dalla quantità di laser applicata per la fotoconversione. La dimensione del ROI può essere ridotta alla dimensione di una singola cella a seconda dell'apertura numerica dell'obiettivo, del fattore di zoom e della quantità di luce laser utilizzata per la fotoconversione.

  1. Selezionare lo strumento Decolorazione e impostare per avviare la decolorazione dopo la scansione 1 di 2. Abbiamo utilizzato un laser a diodi da 30 mW 405 nm per la fotoconversione e abbiamo accuratamente ottimizzato la quantità minima di luce laser necessaria per la fotoconversione completa, che si ottiene principalmente variando l'intensità della luce laser, le iterazioni di scansione del ROI e il tempo di pixel (cioè la velocità di scansione).

Nota 1: Per la fotoconversione abbiamo utilizzato un obiettivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Nota 2: La potenza del laser e il numero di iterazioni devono essere determinati empiricamente per ogni impostazione sperimentale e dovrebbero garantire la completa fotoconversione da PCFP verde a rosso entro il ROI con la quantità minima necessaria di luce laser per ridurre la fototossicità. Si consiglia di iniziare i test utilizzando una bassa potenza laser (ad es. 3 %, corrispondente a 0,03 mW nel piano obiettivo) combinata con un basso numero di iterazioni (ad es. 20), e di aumentare successivamente la potenza laser fino a raggiungere la completa fotoconversione che nelle nostre mani era al 10% della potenza laser (corrispondente a 0,1 mW nel piano obiettivo). In queste condizioni, tutti gli embrioni testati sono sopravvissuti al piano di trattamento. Tuttavia, abbiamo osservato che la membrana del tuorlo è sensibile agli impulsi laser e può essere facilmente danneggiata causando la morte dell'embrione. Per questo motivo, la letalità dell'embrione dopo la fotoconversione può essere causata se la posizione del tessuto bersaglio è vicina al corpo del tuorlo.

  1. Scansiona il campione con uno z-Stack utilizzando laser per 488 nm e 561 nm per visualizzare l'eventuale verde rimanente e la fluorescenza rossa fotoconvertita del PCFP.

Nota 1: Per la scansione dopo la fotoconversione, abbiamo utilizzato un Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

4. Rimuovi l'embrione dall'agarosio

  1. Scartare la soluzione e rimuovere con cura l'embrione dall'LMA all'1% con l'aiuto di un ago o di una punta di plastica liscia.
  2. Mantenere l'embrione in acqua d'uovo al buio a 28,5 °C fino allo stadio di sviluppo desiderato.

Nota 1: È importante che gli embrioni continuino il loro sviluppo nell'acqua d'uovo, in particolare durante i primi giorni di sviluppo durante l'estensione del corpo embrionale. Infatti, alcuni tessuti/organi embrionali cambiano posizione durante lo sviluppo e quindi richiedono orientamenti specifici durante l'inclusione che dipendono dal particolare tessuto/organo di interesse e dallo stadio di sviluppo desiderato dell'analisi.

5. Re-incorporamento

  1. Procedere come indicato al punto 2.) del presente protocollo.

6. Monitoraggio del tessuto fotoconvertito nelle fasi embrionali successive

  1. Scansione della regione di interesse (z-Stack) utilizzando laser per segnali fluorescenti verdi e rossi rispettivamente per 488 nm e 561 nm.

Nota 1: Per la scansione x ore dopo la fotoconversione, abbiamo utilizzato un Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Nota 2: Poiché questo protocollo non influisce sul normale sviluppo dell'embrione, è possibile osservare l'embrione fotoconvertito nelle fasi successive dello sviluppo (per questo, procedere come indicato ai punti 4 - 6).

7. Risultati rappresentativi

Un esempio di saggio di fotoconversione è mostrato nella Figura 1. Abbiamo monitorato le cellule endoteliali durante lo sviluppo del pesce zebra (per una revisione dell'anatomia vascolare del pesce zebra in via di sviluppo vedi16). Di conseguenza, abbiamo utilizzato una linea reporter Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 di zebrafish che esprime KikGR all'interno dei nuclei endoteliali17. Gli embrioni omozigoti e con un'espressione brillante sono stati allevati a 28,5 °C fino a 48 ore dopo la fecondazione (hpf). Dopo la decorioizzazione, gli embrioni sono stati anestetizzati e incorporati in LMA posizionando il lato antero-dorsale dell'embrione verso il vetro di copertura per una migliore visualizzazione dei vasi della testa. Utilizziamo un microscopio confocale invertito (Zeiss LSM 710 Meta) dotato di laser operanti a 405 nm, 488 nm e 561 nm, e un obiettivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8 per il saggio di fotoconversione e l'ulteriore tracciamento della proteina fotoconvertita. Come mostrato nella Figura 1A, prima della fotoconversione, KikGR era espresso all'interno del tessuto endoteliale ed era rilevabile solo come fluorescenza verde utilizzando un laser ad argon da 488 nm. Le scansioni di controllo con un laser DPSS 561-10 da 561 nm per la fluorescenza rossa non hanno rilevato alcun KikGR fotoconvertito prima della fotoconversione (Figura 1A). Successivamente, la ROI è stata completamente fotoconvertita utilizzando un laser a diodi da 405 nm (al 10% di intensità, 20 iterazioni) e i vasi di testa sono stati nuovamente scansionati utilizzando i laser a 488 nm e 561 nm (Figura 1B). Come mostrato nella Figura 1B, il KikGR verde era completamente passato al rosso all'interno del ROI. Dopo il test di fotoconversione, l'embrione è stato rimosso dall'agarosio e sollevato a 28,5 °C in acqua d'uovo. Infine, l'embrione è stato nuovamente osservato 24 ore dopo la fotoconversione, circa 72 hpf, per tracciare le cellule endoteliali fotoconvertite nelle fasi successive (Figura 1C). Pertanto, l'embrione è stato incorporato in LMA e il campione è stato nuovamente scansionato utilizzando i laser a 488 nm e 561 nm. Come mostrato nella Figura 1C, all'interno del tessuto endoteliale derivante dalla ROI fotoconvertita, sono state osservate sia proteine KikGR non convertite che fotoconvertite a causa della stabilità del KikGR fotoconvertito fluorescente rosso e della risintesi di nuovi KikGR verdi non fotoconvertiti.

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Figura 1. Fotoconversione di KikGR durante lo sviluppo del pesce zebra. (A,B) Una regione specifica del sistema vascolare endoteliale della testa è stata fotoconvertita a 48 hpf in embrioni transgenici Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 e (C) osservata nuovamente 24 ore dopo la fotoconversione (circa 72 hpf). Sono mostrati la fluorescenza del KikGR (verde), del KikGR fotoconvertito (rosso) e dei canali uniti. I cerchi tratteggiati mostrano il ROI prima, dopo e 24 ore dopo la fotoconversione. Le immagini sono viste dorsali dell'embrione di pesce zebra, anteriormente al fondo. Barre di scala: 50 μm.

Proteina (acronimo) Ex (nm) Em (nm) Ce QUALITÀ Struttura quaternaria luminosità applicazione Ref Kaede_G 508 518 99 0,9 Tetramero 259 Tracciamento delle celle 2,6 Kaede_R 572 580 60 0,3 Tetramero 59 KikGR_G 507 517 54 0,7 Tetramero 112 Tracciamento delle celle 3,6,8-10 KikGR_R 583 593 35 0,6 Tetramero 68 mKikGR_G 505 515 49 0,7 monomero 101 Tracciamento dinamico Immagini a superrisoluzione 13 mKikGR_R 580 591 28 0,6 monomero 53 EosFP_G 506 516 72 0,7 Tetramero 150 Tracciamento delle celle 5,20 EosFP_R 571 581 41 0,5 Tetramero 67 tdEos_G 506 516 34 0,7 dimero tandem 165 Immagini in superrisoluzione 12,14,21 tdEos_R 569 581 33 0,6 dimero tandem 59 mEos2_G 506 519 56 0,7 monomero 140 Tracciamento dinamico Immagini a superrisoluzione 11,18 mEos2_R 573 584 46 0,7 monomero 90 Dendra2_G 490 507 45 0,5 monomero 67 Tracciamento dinamico Immagini a superrisoluzione 4,11 Dendra2_R 553 573 35 0,55 monomero 57

Tabella I. Proprietà delle proteine fluorescenti fotoconvertibili. Insieme al nome comune e/o all'acronimo per ciascun PCFP, nella tabella sono mostrate le lunghezze d'onda di eccitazione di picco (Ex) e di emissione (Em), i coefficienti di estinzione molare (EC, 10-3 M-1 cm-1), la resa quantica (QY), la struttura quaternaria fisiologicamente rilevante, la luminosità relativa (come % di EGFP), l'applicazione e i riferimenti. Tabella adattata da Day e Davidson, 20101.

PCFP Linee transgeniche di pesce zebra fonte Kaede Tg(elavl3:Kaede)rw0130a Laboratorio di Okamoto Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:Kaede)   Tg(ins:Kaede)   Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)   Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ ZIRC Tg(myl7:kaede)   Tg(olig2:Kaede)   Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t ZIRC Tg(UAS:Kaede)rk8 ZIRC Tg(vsx2:Kaede)nns2 Laboratorio Higashijima KikGR Tg(kdrl:nlsKikGR)   Tg(krt4:NTR-KikGR)   Tg(myl7:nlsKikGR)   Tg(sox10:KikGR)   Tg(UAS:KikGR)   EosFP Tg(sox10:EosFP)   Tg(sox10:nlsEosFP)   Dendra Tg(-8mpx:Dendra2)   Tg(UAS:Dendra-kras)  

Tabella II. Linee transgeniche di zebrafish che esprimono PCFPs. Dati ottenuti nel database degli organismi modello di pesce zebra (ZFIN, http://zfin.org/). È indicata la disponibilità di linee nel Zebrafish International Resource Center (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/).

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Discussione

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Negli ultimi anni sono stati generati modelli animali transgenici per l'espressione di proteine fotoconvertibili come Kaede o KikGR. Questi animali si sviluppano normalmente, indicando che queste proteine non hanno effetti tossici sullo sviluppo embrionale. Il primo rapporto su un saggio di fotoconversione per il tracciamento delle cellule in embrioni animali è stato eseguito da Hatta e collaboratori mediante iniezione di mRNA o DNA che codifica Kaede in embrioni di zebrafish unicellulari per l'espressione ubiquitaria, o...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Ian C. Scott per aver gentilmente fornito la linea transgenica Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 al Hospital for Sick Children, Toronto, Canada. Ringraziamo la Core Facility di Microscopia Confocale e 2-Photon (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) e il Dr. Zoltan Cseresnyes, per l'eccellente assistenza tecnica e il supporto generale all'imaging. S.A.-S. è sostenuto da una borsa di studio Heisenberg della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione DFG SE2016/7-1.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali:
Attrezzatura necessaria per l'allevamento dei pesci e la raccolta delle uova (vedi il Zebrafish Book22 per i dettagli).
StereomicroscopioLeicaLecia MZ6 StereomicroscopioDotato di laser operante a 488 nm
Microscopio a scansione laser confocaleZeissZeiss LSM 710 NLOdotato di laser operanti a 488 nm, 561 nm e 405 nm
Blocco
Coppia di pinze
Piatto di coltura con fondo di vetroMatTek CorpPunte
per pipette per microloaderAghi Eppendorf
Vortex
Reagenti:
Acqua d'uovo media
60 μ g/ml Sali marini oceanici istantanei in ddH2O
E3 medium
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO4
0.00001% (p/v) Blu di metilene
4 mg/ml Soluzione madre di tricaina
400 mg Tricaina (3-amminoacido benzoicoetilestere)Sigma-Aldrich
97.9 ml ddH2O
2.1 ml 1M Tris (pH9)
Regolare a pH 7, aliquotare e conservare -20 ° C
1% LMA (Agarosio a bassa temperatura di fusione, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 medium 1X
Aliquot e conservare a 4 ° E
riscaldanteDumont #5 Ashland MA USA

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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