I passi necessari per la sintonizzazione quotidiana e ottimizzazione delle prestazioni di un citometro massa CyTOF sono descritti. Commenti sulla preparazione del campione ottimale e portata sono discussi
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Articolo metodologico
Massa Citometria: Protocollo per l'ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli ultimi anni, l'analisi rapida di singole cellule è comunemente eseguita utilizzando citometria di flusso e anticorpi marcati in fluorescenza. Tuttavia, la questione della sovrapposizione spettrale delle emissioni di fluorofori ha limitato il numero di sonde simultanee. In contrasto, la nuova massa citometro CyTOF da DVS coppie Scienze un liquido a cella singola introduzione di un sistema ICP-MS. 1 Invece di fluorofori, polimeri chelanti contenenti isotopi metallici altamente arricchito sono accoppiati ad anticorpi o altre sonde specifiche. 2-5 A causa della purezza del metallo e la risoluzione di massa del citometro massa, non vi è alcuna "sovrapposizione spettrale" di isotopi vicini, e quindi senza necessità di matrici di compensazione. Inoltre, grazie all'utilizzo di metalli lantanidi, non c'è sfondo biologico e quindi non equivalente di autofluorescenza. Con una finestra massa estende massa atomica 103-203, teoricamente fino a 100 etichette possono essere distinti contemporaneamente. Attualmente, Più di 35 canali sono disponibili utilizzando i reagenti chelante disponibile da DVS Sciences, che consente la dissezione senza precedenti del profilo immunologico dei campioni. 6-7
Svantaggi citometria massa includono il requisito rigido per un isotopo metallico separato per sonda (non equivalente di dispersione in avanti o laterale), e il fatto che si tratta di una tecnica distruttiva (senza possibilità di recupero cernita). L'attuale configurazione del citometro massa ha anche una velocità di trasmissione di cella solo ~ 25%, richiedendo così un numero di ingresso maggiore di cellule.
Ottima performance giornaliera del citometro massa richiede diversi passaggi. L'obiettivo fondamentale della ottimizzazione è quello di massimizzare l'intensità di segnale misurata degli isotopi metallici desiderati (M), riducendo al minimo la formazione di ossidi (M 16) che diminuisce l'intensità del segnale e M interferire con qualsiasi segnale desiderato a M 16. Il primo passo è di riscaldare la macchina in un caldo, stabile ICP plasma è stato stabilito. In secondo luogo, le impostazioni per la frequenza del gas corrente e il make-up di flusso deve essere ottimizzata su base giornaliera. Durante il prelievo, il massimo tasso di eventi cella è limitato dal rilevatore efficienza e velocità di elaborazione a 1000 cellule / secondo. Tuttavia, a seconda della qualità di esempio, un più lento tasso di eventi cella (300-500 cellule / secondo) è generalmente auspicabile consentire una migliore risoluzione tra eventi cellule e quindi massimizzare singlets intatte nel doppietti e detriti. Infine, adeguata pulizia della macchina alla fine della giornata aiuta a minimizzare il segnale di fondo per metallo libero.
Protocollo
Tutti i campioni di cellule per la CyTOF devono essere fissate e permeabilizzate. Questo consente una maggiore entrata del iridio contenente DNA intercalante, e impedisce anche lisi cellulare durante il lavaggio con acqua MilliQ e gradini risospensione immediatamente prima di iniettare nel citometro massa.
1. Start-up del citometro Messa
- Aprire il programma CyTOF software. Selezionare Impostazione dello strumento. Nella scheda Cage Card, andate nell'angolo in basso a destra e fare clic su Riscaldatore "ON". Accendere il riscaldatore almeno 15 minuti prima del tempo desiderato per dare il tempo sufficiente per il mantello de....
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Risultati
Dopo il protocollo di cui sopra dovrebbe realizzare quattro cose. In primo luogo, consentendo un adeguato tempo di riscaldamento per il citometro massa produrrà un caldo, plasma stabile necessario per il segnale ottimale e minima formazione di ossido. Secondo, lavaggio adeguato del citometro massa con acqua e soluzione di lavaggio MilliQ DVS (Figura 9) contribuirà a ridurre i livelli di metallo assorbimento nella tubazione e altre parti della macchina, contribuendo a ridurre fondo durante l'acquisiz.......
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Discussione
Per questi ultimi decenni, la citometria a flusso di fluorescenza è stato un metodo cavallo di lavoro per analizzare cellule singole, sia in termini di espressione di superficie e in saggi funzionali. Tuttavia, i problemi di sovrapposizione spettrale dei coloranti fluorescenti ha limitato il numero di marcatori simultanei. Mentre gli esperimenti che utilizzano più di 12 marcatori simultanei sono stati riportati, l'importo della compensazione necessaria rende tecnicamente difficile.
Invec.......
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Dichiarazioni
Gli autori lavorano entrambi presso il Centro di monitoraggio immunitario umano, un centro di assistenza presso la Stanford University che impone diritti degli utenti esclusivamente per coprire i costi di saggi, tra cui citometria di massa.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dott. Evan Newell e il Dr. Sean Bendall per il feedback. Vorremmo anche ringraziare DVS Sciences e il Dr. Sean Bendall per un campione delle Multi-lantanidi contenenti perline di polistirene. Siamo grati per il finanziamento dal NIH Grant 2 U19 AI057229.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| CyTOF TM massa citometro | DVS Sciences | ||
| Soluzione di lavaggio | DVS Sciences | 201071 | 0,05% di acido fluoridrico in acqua |
| Sintonizzazione soluzione | DVS Sciences | 201072 | 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, acido nitrico traccia |
| Eu contenenti perline di polistirene | DVS Sciences | 201073 | Contiene naturale abbondanza isotopi Eu; perline in dotazione a circa 1 milioni / mL |
| Multi-contenenti lantanidi (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polistirolo perle | DVS Sciences | Non ancora disponibile in commercio | Contiene naturale abbondanza isotopi di lantanidi quotate |
| Acido nitrico (concentrato) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima traccia-metallo puro ICP-MS di qualità |
| Polistirene fondo rotondo tubo con cellule-filtro cap-5 ml | BD | 352235 | utilizzato per filtrare campioni di cellule prima dell'iniezione |
| Norm-Ject tuberkulin siringa 1 ml | Henke Sass Lupo | 4010-200V0 | senza silicone, latex-free |
| Norm-Ject siringa 3 ml | Henke Sass Lupo | 4010.000V0 | senza silicone, latex-free |
| MilliQ acqua | 18 MW di acqua pura, non deve essere conservato in bottiglie di vetro o di plastica che sono stati lavati con detersivo commerciale (a causa della loro elevati livelli di bario presenti). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | detergente acido |
| Gas argon | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-alta purezza |
Riferimenti
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer....
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Ristampe e permessi
