Un nuovo metodo che utilizza l'analisi quantitativa di FRET (Förster Resonance Energy Transfer) segnali è descritto per lo studio di cinetica enzimatica. K M E K Cat Sono stati ottenuti per l'idrolisi del dominio catalitico di SENP1 (SUMO / Sentrin specifica proteasi 1) di controllare la validità SUMO1 (Small ubiquitina-like Modifier). I principi generali della presente quantitativa-FRET-based studio cinetico proteasi può essere applicato ad altre proteasi.
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Articolo metodologico
Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) analisi per la determinazione della proteasi SENP1 Cinetica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Reversibili modificazioni post-traduzionali di proteine con proteine ubiquitina o ubiquitina-like (Ubls) sono ampiamente utilizzati per regolare in modo dinamico l'attività della proteina e hanno ruoli diversi in molti processi biologici. Ad esempio, SUMO modifica covalentemente un numero grande o proteine con un ruolo importante in molti processi cellulari, tra cui cellule-regolazione del ciclo, la sopravvivenza cellulare e la morte, danno la risposta del DNA e risposta allo stress 1-5. SENP, come SUMO-specifiche proteasi, funziona come un endopeptidasi nella maturazione dei precursori SUMO o come isopeptidase per rimuovere SUMO dalle sue proteine bersaglio e aggiornare il ciclo sumoilazione 1,3,6,7.
L'efficienza catalitica o specificità di un enzima è meglio caratterizzato dal rapporto delle costanti cinetiche, k cat / K M. In diversi studi, i parametri cinetici di SUMO-SENP coppie sono state determinate con vari metodi, tra cui gel di poliacrilammide-based western blot, radIOActive-marcato substrato, composto fluorescente o proteina marcata substrato 8-13. Tuttavia, le poliacrilammide-gel a base di tecniche, che hanno utilizzato i "nativi", ma le proteine sono laboriosi e tecnicamente impegnativo, che non si prestano ad una dettagliata analisi quantitativa. Il ottenuta k cat / K M da studi usando tetrapeptidi o proteine con ACC (7-ammino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-ammino-4-metil) fluoroforo erano o fino a due ordini di grandezza inferiore ai substrati naturali o non può chiaramente distinguere le iso-e attività di endopeptidasi SENPs.
Saggi della proteasi Recentemente, FRET-based sono stati utilizzati per studiare gli enzimi deubiquitinating (Dubs) o SENPs con il FRET coppia di proteina fluorescente ciano (PCP) e giallo proteina fluorescente (YFP) 9,10,14,15. Il rapporto di emissione dell'accettore di emissione del donatore è stato utilizzato come parametro quantitativo per FRET segnale monitor per proteasi acproduttività determinazione. Tuttavia, questo metodo ignorato segnale contaminazioni crociate al accettore e lunghezze d'onda di emissione del donatore e accettore da donatore auto-fluorescenza e quindi non era accurata.
Abbiamo sviluppato un nuovo altamente sensibile e quantitativa FRET saggio basato proteasi per determinare i parametri cinetici di pre-SUMO1 maturazione da SENP1. Un multistrato FRET CyPet coppia e YPet con significativamente migliorato FRET efficienza e resa quantica di fluorescenza, sono stati utilizzati per generare il CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrato 16. Abbiamo differenziato e quantificato assoluti segnali di fluorescenza fornite dal donatore e accettore FRET e alle lunghezze d'onda di emissione e accettori, rispettivamente. Il valore di k cat / K M è stato ottenuto come (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 SENP1 verso di pre-SUMO1, che è in accordo con i parametri generali cinetica enzimatica. Pertanto, questo metodo è valido e può essere utilizzato unsa generale approccio per caratterizzare proteasi anche altri.
Protocollo
1. Costrutti plasmidici
- Amplificare le fasi di lettura aperte dei geni mediante PCR, e clonare i prodotti di PCR in pCRII-TOPO vettore.
- Confermare i prodotti dal sequenziamento, e clonare il cDNA codificante CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domini catalitici di SENP1 nella (b) pET28 vettore con un N-terminale tag hexahistidine.
2. Espressione e purificazione di proteine
- Trasformare cellule di Escherichia coli ceppo BL21 (DE3) con pET28 (b) vettori codificanti CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ed i domini catalitici di SENP1.
- Coltivato i batteri trasformat....
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Discussione
FRET tecnologia è stata usata per studiare la maturazione pre-SUMO1 da parte SENP1 9. CFP-YFP è stato usato come FRET coppia e analisi raziometrico, che è il rapporto tra accettore di emissioni donatori, è stato utilizzato per caratterizzare le proprietà cinetiche. Tuttavia, non vi è alcuna considerazione di donatore e accettore auto-fluorescenza nella raziometrica tradizionale analisi FRET. Il rapporto non è direttamente correlata con la quantità di substrato digerito.
Qui riport.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo molto grati a Victor GJ Rodgers per preziosi consigli. Ringraziamo tutti i membri del gruppo di Liao per molto stretto lavoro di collaborazione e di aiuto con questo studio. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant AI076504 a JL).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 | |
| 2xYT | Ricerca Prodotti Internationa.l Corp. | X15600 | |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 | |
| Coomassie più (Bradford) Regent Assay | Thermo Scientific | 23238 | |
| Piastra a 384 pozzetti (inferiore di vetro) | Greiner | 781892 | |
| FlexStation II 384 lettore di piastre | Dispositivo molecolare |
Riferimenti
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T.
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Ristampe e permessi
