Articolo metodologico

Microgavage di larve Zebrafish

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DOI:

10.3791/4434

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20 febbraio 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un nuovo metodo di microsonda gastrica per i pesci zebra larvali che utilizza attrezzature standard per microiniezioni di embrioni e stereomicroscopia. Dimostriamo che la microsonda gastrica è una tecnica sicura ed efficiente, utile per somministrare quantità controllate di diversi materiali direttamente nella cavità intestinale delle larve di pesce zebra.

Abstract

Il pesce zebra si è affermato come un organismo modello potente per lo studio dello sviluppo intestinale1-5, della fisiologia6-11, delle malattie12-16 e delle interazioni ospite-microbo17-25. Gli approcci sperimentali per lo studio della biologia intestinale richiedono spesso l'introduzione in vivo di materiali selezionati nella cavità intestinale. Nel modello del pesce zebra larvale, ciò viene tipicamente ottenuto immergendo i pesci in una soluzione del materiale scelto oppure mediante iniezione attraverso la parete addominale. Con il metodo dell'immersione, risulta difficile monitorare o controllare con precisione il percorso o il momento del rilascio del materiale nell'intestino. Per questo motivo, l'esposizione per immersione può causare tossicità indesiderata e altri effetti su tessuti extraintestinali, limitando l'intervallo di quantità di materiale che possono essere somministrate nell'intestino. Inoltre, la quantità di materiale ingerito durante l'esposizione per immersione può variare notevolmente tra larve singole26. Sebbene questi problemi non si verifichino con l'iniezione diretta attraverso la parete addominale, tale procedura risulta difficoltosa e provoca danni ai tessuti che potrebbero influenzare i risultati sperimentali. Presentiamo un metodo di microsonda gastrica per larve di pesce zebra. L'obiettivo di questo metodo è fornire un modo sicuro, efficace e riproducibile per somministrare materiali direttamente nella cavità dell'intestino anteriore di larve di pesce zebra, con un controllo temporale preciso. La microsonda gastrica utilizza attrezzature standard per microiniezione di embrioni e stereomicroscopi comuni nella maggior parte dei laboratori che svolgono ricerche sul pesce zebra. Una volta posizionati correttamente i pesci nella metilcellulosa, la sonda gastrica può essere eseguita rapidamente a un ritmo di circa 7-10 pesci/min, e la sopravvivenza post-sonda si avvicina al 100%, a seconda del materiale somministrato. Mostriamo inoltre che la microsonda gastrica consente il caricamento della cavità intestinale con alte concentrazioni di materiali che risultano letali ai pesci se somministrati per immersione. Per dimostrare l'utilità di questo metodo, presentiamo un saggio di microsonda gastrica con dextrano fluorescente che può essere utilizzato per quantificare il transito dalla cavità intestinale verso spazi extraintestinali. Questo test può essere impiegato per verificare l'esecuzione corretta della procedura di microsonda gastrica e fornisce inoltre un nuovo saggio nel pesce zebra per esaminare l'integrità della barriera epiteliale intestinale in diverse condizioni sperimentali (e.g. manipolazione genetica, trattamento farmacologico o esposizione a fattori ambientali). Inoltre, mostriamo come la sonda gastrica possa essere utilizzata per valutare la motilità intestinale, somministrando microsfere fluorescenti e monitorandone il successivo transito. La microsonda gastrica può essere applicata per somministrare diversi materiali, come microrganismi vivi, fattori microbici secreti o tossine, agenti farmacologici e sonde fisiologiche. Grazie a queste capacità, il metodo di microsonda gastrica per larve di pesce zebra ha il potenziale di arricchire un'ampia gamma di settori di ricerca che utilizzano il sistema modello del pesce zebra.

Protocollo

Utilizziamo protocolli pubblicati per la gestione e la manutenzione standard del pesce zebra al fine di ottenere larve per la microgavaggio27. Riproduciamo principalmente i pesci mediante riproduzione naturale, mantenendoli in un ciclo di 14 ore di luce e 10 ore di buio. Questo protocollo è stato ottimizzato per la microgavaggio di larve di pesce zebra a 6-7 giorni post-fecondazione (dpf). Prevediamo che questi metodi possano essere generalmente applicabili a stadi di sviluppo più giovani e più anziani con modifiche minori. Salvo diversa indicazione, abbiamo utilizzato ceppi selvatici di pesce zebra TL a 6 dpf, e i pesci non sono stati alimentati. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in acqua di sistema ottenuta dal nostro impianto convenzionale di acquacoltura del pesce zebra; tuttavia, può essere utilizzato qualsiasi mezzo appropriato per pesce zebra (ad es. mezzo per embrioni o mezzo gnotobiologico per pesce zebra (GZM)28). In questo protocollo, ci riferiamo a "mezzo per pesce zebra" per indicare il mezzo scelto dall'utilizzatore.

1. Preparazione della metilcellulosa, del modello per sondino gastrico e della fabbricazione dell'ago per microsondaggio

Il giorno prima o la mattina stessa dell'esperimento, preparare la metilcellulosa, lo stampo in agarosio per la stabilizzazione delle larve e gli aghi per la microsondaggio.

  1. Sciogliere 3 g di metilcellulosa in 100 ml di acqua sterile deionizzata o in mezzo per zebrafish (a seconda dell'applicazione) per ottenere una soluzione al 3%. Aggiungere una barretta magnetica al flacone, riscaldare l'acqua fino a raggiungere una temperatura prossima all'ebollizione e posizionare il flacone su un agitatore magnetico a velocità elevata. Durante l'agitazione, aggiungere lentamente la metilcellulosa in modo da evitare la formazione di grumi. Ridurre gradualmente la velocità di agitazione e la temperatura dell'agitatore nel corso della giornata fino a raggiungere la temperatura ambiente.
  2. Continuare ad agitare lentamente per tutta la notte fino a quando la metilcellulosa si sarà completamente sciolta. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente per diversi mesi in un contenitore sigillato.
  3. Preparare un mold di agarosio al 3% in una piastra di Petri da 10 cm utilizzando un calco in plastica (Adaptive Science Tools, TU-1) seguendo le istruzioni del produttore. Sigillare con pellicola parafilm e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso per prevenire la disidratazione. Riscaldare a temperatura ambiente o a 28 °C prima dell'esperimento. I mold di agarosio possono generalmente essere riutilizzati diverse volte.
  4. Prelevare diversi aghi per gavaggio utilizzando capillari in vetro borosilicato e un estrattore per micropipette Flaming Brown (FT330B) dotato di un filamento riscaldante a vaschetta larga. I programmi che utilizziamo per la fabbricazione degli aghi sono i seguenti:
Tipo di agoPressioneCaloreTrazioneVelocitàTempo
embrione50031510050200
gavaggio50031512575200

Poiché i filamenti possono variare tra strumenti diversi, registrare il tempo di salita (tempo di riscaldamento attivo). Il nostro tempo di salita varia tra 8,57 e 8,79 ms per questo programma. Questo programma produce aghi più corti e tozzi rispetto agli aghi per microiniezione tradizionali (Figura 1). Queste impostazioni potrebbero richiedere un'ottimizzazione per essere utilizzate con diversi estrattori di micropipette.

2. Taglio, caricamento e calibrazione degli aghi per microsonda gastrica

Nota*: Il taglio dell'ago è un passaggio critico in questo protocollo. Inoltre, i metodi per il caricamento e la calibrazione dell'ago variano a seconda del tipo di unità di microiniezione utilizzata. Abbiamo ottimizzato questo protocollo impiegando microiniettori Drummond II, ma prevediamo che lo stesso possa essere applicabile anche ad altri strumenti di microiniezione con modifiche minori. Poiché i dispositivi per iniezione e i puller per aghi possono variare da laboratorio a laboratorio, sarà importante misurare e calibrare i volumi di iniezione (vedere sezione 2.8).

  1. I aghi vengono tagliati sotto un microscopio stereoscopico. Utilizziamo un microscopio stereoscopico Leica S6E impostato a un ingrandimento di 2,5x. A questa impostazione, il reticolo oculare con 100 divisioni ha una lunghezza di 2 mm.
  2. Allineare la punta dell'ago con l'estremità del reticolo (marcatura della divisione 100) e tagliare l'ago utilizzando pinzette da orologiaio a punta fine a circa 1 mm dalla punta (marcatura della divisione 48-50) (Figura 1A).
  3. L'ago dovrebbe avere un diametro di circa 27-30 μm ed essere smussato. Esaminare le punte degli aghi a un ingrandimento di 100x. Gli aghi appuntiti o irregolari aumentano la probabilità di danni durante la gavaggio e, se possibile, vanno evitati.
  4. In alternativa, quando disponibile, si può utilizzare un microforno per controllare meglio il punto di taglio dell'ago e per lucidare a fiamma le sue punte, eliminando i bordi taglienti (Figura 1B).
  5. Preparare la soluzione per il gavaggio. Per la maggior parte delle applicazioni, prepariamo la soluzione aggiungendo una diluizione 1:10 di una soluzione al 0,5% di rosso fenolo in soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS) (Sigma-Aldrich), in modo da rendere visibile la soluzione al microscopio stereoscopico per monitorare il corretto funzionamento del microiniettore e la posizione della soluzione nel bulbo anteriore. Altri coloranti non sono stati valutati ma potrebbero essere utilizzati.
  6. Preparare l'ago per il gavaggio riempiendolo con olio minerale mediante una siringa da 1 ml dotata di ago 25G 5/8. Montare quindi sull'unità di microiniezione Nanoject II.
  7. Avvolgere una piastra di Petri in plastica da 10 cm con parafilm per ottenere una superficie piana e impermeabile e depositare un'aliquote di circa 2 μl della soluzione per il gavaggio sul parafilm. Riempire manualmente l'ago per il gavaggio, facendo attenzione a non creare bolle d'aria nell'olio minerale.
  8. Per verificare il funzionamento del microiniettore e calibrare il volume di espulsione, riempire una piastra di Petri da 3 cm con olio minerale e iniettare nell'olio fino a ottenere gocce di dimensioni costanti. Misurare il diametro delle gocce utilizzando il reticolo o una funzione di misura del microscopio stereoscopico, se disponibile. Calcolare il volume delle gocce (Equazione: V=4/3πr3). La coerenza del volume tra diversi aghi viene riportata graficamente (Figura 1C).
  9. Risciacquare la punta dell'ago immergendola ripetutamente in mezzo per zebrafish pulito per rimuovere l'olio minerale residuo prima di iniziare il gavaggio. L'olio minerale è molto denso e potrebbe danneggiare i tessuti epiteliali se non viene rimosso dalla punta dell'ago.

3. Anestesia, montaggio e somministrazione per sondino nei larve di pesce zebra

  1. Riscaldare lo stampo in agarosio a temperatura ambiente o a 28 °C prima dell'esperimento.
  2. Preparare lo stampo in agarosio per la gavaggio coprendo 3 scanalature con metilcellulosa al 3%. Utilizzare una quantità di metilcellulosa sufficiente a coprire le scanalature e trattenere i pesci, ma non così scarsa da asciugarsi rapidamente.
  3. In una piastra da 6 pozzetti pulita, distribuire i larvi di zebrafish per ciascun gruppo sperimentale in pozzetti separati, ciascuno contenente 3,5-4,0 ml di mezzo per zebrafish.
  4. Preparare una soluzione di tricaina 3x (0,05% p/v) nel mezzo per zebrafish appropriato. Anestetizzare i pesci un pozzetto alla volta mescolando un volume uguale di tricaina 3x nel pozzetto contenente i larvi, ottenendo una concentrazione finale di 1,5x (0,025%), e agitare delicatamente.
  5. Non appena i zebrafish smettono di muoversi, rimuoverli dal pozzetto utilizzando una pipetta Pasteur in vetro a largo foro e una pompa per pipetta, e posizionarli uno alla volta sulla metilcellulosa con la testa sull'angolo di 45° della scanalatura e la coda rivolta verso l'angolo di 90°. Premere delicatamente con una sonda da dissezione smussata per stabilizzarne la posizione.
  6. Regolare l'apparato di microiniezione Nanoject II in modo che l'ago sia inclinato con un angolo leggero approssimativamente parallelo all'angolo di 45° dello stampo in agarosio. Assicurarsi che l'escursione dell'ago sia sufficiente a raggiungere il fondo del pozzetto dello stampo, in modo da ridurre al minimo le regolazioni una volta posizionati i pesci.
  7. Impostare l'unità di microiniezione per rilasciare 4,6 nl (massimo) con l'impostazione di iniezione lenta (23 nl/sec). Con queste impostazioni, il volume erogato dovrebbe riempire appena la porzione anteriore della vescica intestinale senza fuoriuscire dall'esofago o dalla cloaca. Volumi inferiori possono essere utilizzati a seconda dello scopo dell'esperimento.
  8. Utilizzare una mano per effettuare piccole regolazioni della piastra contenente i larvi immobilizzati, mentre contemporaneamente si controlla con l'altra mano il manipolatore dell'unità di microiniezione.
  9. Manovrare delicatamente l'ago da gavaggio nella bocca del pesce anestetizzato, attraverso l'esofago, e premere leggermente lo sfintere esofageo per introdurre la punta dell'ago da gavaggio appena all'interno della vescica intestinale anteriore (Figura 2, passo 1-2, a&b).
  10. Una volta all'interno della vescica anteriore, premere delicatamente il pedale o il pulsante di iniezione per somministrare il materiale. Ritirare rapidamente e con fluidità l'ago, cercando di non rilasciare quantità significative di materiale nell'esofago (Figura 2, passo 3-4).
  11. Dopo la gavaggio, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro a largo foro e una pompa per pipetta per spostare delicatamente i larvi di zebrafish in un mezzo fresco. Riempire la pipetta con acqua fino a circa 2,5 cm sopra la curvatura del collo, creare una piccola sacca d'acqua nella metilcellulosa vicino alla testa del larva per liberarlo, sollevare delicatamente la testa all'interno della bocca della pipetta ed estrarre il larva dalla metilcellulosa. Espellere delicatamente il pesce e tutta l'acqua dalla pipetta in una capsula con mezzo fresco.
  12. Risciacquare i larvi nel mezzo fresco aspirando e rilasciando delicatamente con la pipetta o schizzandoli con il mezzo diverse volte per rimuovere la metilcellulosa e far riprendere i larvi dall'anestesia. Trasferire i larvi in una capsula Petri o in una piastra a 6 pozzetti fino al momento dell'analisi o dell'imaging successivo.

4. Saggio con dextrano per verificare la sicurezza della gavaggio e l'integrità della barriera intestinale

La microsonda gastrica può essere utilizzata per somministrare diversi materiali nell'intestino. A titolo di esempio, di seguito viene fornito un protocollo per la somministrazione per sondino gastrico di una destrana da 10 kD coniugata con Texas Red, al fine di analizzare l'integrità della barriera dell'epitelio intestinale. Esistono almeno due possibili vie di permeabilità paracellulare, con differenze di selettività in base alla carica e alle dimensioni dei soluti, definite rispettivamente vie del "poro" o della "perdita"29. Poiché questa destrana è troppo grande per essere assorbita attraverso l'epitelio intestinale lungo la via paracellulare del poro (limite dimensionale ~4Å, destrana da 10 kD = ~23Å)9,30-32, dovrebbe rimanere all'interno della cavità luminale se l'integrità della barriera intestinale non è compromessa. Sebbene la destrana da 10 kD possa essere trasportata attraverso la via paracellulare della perdita, questa via ha una capacità inferiore e una cinetica più lenta29,33 e, pertanto, è poco probabile che si verifichi entro il periodo di tempo previsto per questo saggio. Un trattamento di "controllo positivo" per alterare l'integrità della barriera è rappresentato dall'aggiunta di EDTA, che altera le giunzioni strette dell'epitelio34,35. Questo saggio con destrana somministrata per sondino gastrico può essere utilizzato come test di controllo qualità per dimostrare che la procedura di sondino gastrico viene eseguita in modo sicuro, senza danni tissutali involontari. Inoltre, questo saggio può essere impiegato per valutare l'integrità della barriera intestinale in funzione del genotipo o del trattamento.

  1. Preparare le seguenti soluzioni per la gavaggio: 1% dextrano/1x PBS/0,05% rosso fenolo e 1% dextrano/20 mM EDTA/1x PBS/0,05% rosso fenolo (controllo positivo). La soluzione madre al 5% di dextrano in ddH2O viene conservata in aliquote da 50 μl a -20 °C per ridurre il numero di cicli di congelamento-scongelamento. Inoltre, preparare una soluzione di controllo contenente 1x PBS/0,05% rosso fenolo.
    controllo + (EDTA)senza EDTA
 soluzione madrefinalefattore di diluizione10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Destrano5%1%522
PBS10x1x1011
Rosso fenolo0,50%0,05%1011
   sottototale:54
   ddH2O:56
   Totale:1010
  1. Utilizzare il protocollo descritto nella sezione 3 per somministrare per via orale a gruppi di 10-20 larve di pesce zebra per ciascuna condizione sperimentale. Ripetere l'operazione su gruppi duplicati o triplicati, se possibile.
  2. Dopo la somministrazione orale, recuperare le larve dall'anestesia e lasciarle nuotare liberamente in un mezzo fresco.
  3. 18-20 minuti dopo la somministrazione orale, anestetizzare nuovamente le larve come descritto al punto 3.3. Posizionare le larve in metilcellulosa al 3% sopra un blocco di agarosio al 3% (questo riduce l'abbagliamento di fondo durante l'acquisizione delle immagini).
  4. Acquisire le immagini delle larve mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza (e.g., Leica M205C) e un filtro Texas Red, utilizzando un ingrandimento che permetta di visualizzare le larve dal muso fino immediatamente posteriormente all'estremità della cloaca.
  5. Acquisire tutte le immagini con le stesse impostazioni di esposizione in modo da poterle quantificare e confrontare successivamente. La fluorescenza sarà intensa nella luce intestinale di tutte le larve iniettate con dextrano, ma la funzione della barriera viene valutata in base al livello di dextrano che appare nei tessuti extra-intestinali (i.e., tronco e vasi sanguigni) (Figura 5). Regolare l'esposizione in modo da visualizzare la fluorescenza del tronco, anche se ciò comporta un'eccessiva esposizione della fluorescenza della luce intestinale.
  6. Staggerare i tempi di somministrazione orale in modo che ogni gruppo trascorra approssimativamente lo stesso tempo di recupero dopo la somministrazione e venga acquisito in momenti simili dopo la somministrazione. Per questo esperimento, ogni gruppo richiede circa 1 ora per essere completato da una persona. I pesci vengono anestetizzati a 18-20 minuti dalla somministrazione orale e l'acquisizione delle immagini richiede circa 1-2 minuti per pesce.
  7. Utilizzare un software di analisi delle immagini come ImageJ per quantificare l'intensità media relativa della fluorescenza in una regione del tronco appena sopra l'intestino. Normalizzare questi valori sottraendo una misura del fondo acquisita in una zona dell'immagine esterna al pesce.
  8. Rappresentare graficamente e analizzare i dati ottenuti dall'analisi delle immagini utilizzando GraphPad Prism o un software statistico simile.

5. Saggio con microsfere fluorescenti per testare la motilità intestinale

La somministrazione per gavaggio consente un maggiore controllo sui tempi e sulla quantità di materiale introdotto nell'intestino, rendendola un metodo alternativo ideale per studi sulla motilità intestinale. Tecniche precedentemente pubblicate per misurare la motilità intestinale nei larve di zebrafish includono l'osservazione diretta di contrazioni e onde intestinali mediante microscopia1,21,36, oppure l'alimentazione delle larve con cibo mescolato a microsfere fluorescenti in polistirene di colore giallo-verde26. In alcuni studi, la quantificazione dei modelli di motilità intestinale è stata migliorata immergendo le larve in un mezzo contenente colorante alimentare37 o mediante una tecnica specializzata di analisi video chiamata mappatura spaziotemporale38,39. In questo studio forniamo una dimostrazione di principio per mostrare che è possibile effettuare un gavaggio di microsfere fluorescenti nella vescica intestinale anteriore e che il tracciamento del movimento delle microsfere può essere utilizzato per valutare la motilità intestinale (Figura 6). La differenza principale tra questo metodo e l'approccio di Field e colleghi26 consiste nel fatto che le perle vengono introdotte singolarmente e non possono essere incorporate nel cibo a causa dei limiti del diametro dell'ago per gavaggio.

  1. Mantenere larve di zebrafish in piastre da 10 cm con 35 ml di mezzo fino all'esecuzione dell'esperimento a 7 dpf. Iniziare a nutrire le larve una volta al giorno al mattino a partire da 5 dpf con circa 0,6 mg di cibo in polvere (dieta per larve, come precedentemente descritta40; somministrato utilizzando un’ansa inoculante sterile da 1 mm).
  2. Agitare delicatamente il flacone di microsfere di polistirene Fluoresbrite YG da 2,0 μm (~2,5% sospensione acquosa) per omogeneizzare la sospensione. Aliquotare una goccia del flacone su parafilm in modo da poter misurare un volume specifico mediante pipetta.
  3. In una provetta eppendorf, centrifugare le perle a bassa velocità in una microcentrifuga da banco, rimuovere il soprannatante e sostituirlo con PBS 1x fino al volume originale. Ripetere questa procedura per lavare le microsfere per 2 volte.
  4. Preparare una sospensione per gavaggio contenente 0,25% di microsfere (diluizione 1:10 della sospensione madre)/PBS 1x/0,05% di rosso fenolo. Nell'volume di gavaggio di 4,6 nl somministrato per larva sono presenti circa 2,6x103 microsfere.
  5. Utilizzare il protocollo descritto nella sezione 3 per effettuare il gavaggio del numero desiderato di larve. Le microsfere sono leggermente galleggianti; pertanto, il gavaggio deve essere eseguito il più rapidamente possibile per massimizzare l'uniformità della sospensione.
  6. In questo esperimento, 15 larve sono state sottoposte a gavaggio e successivamente mantenute singolarmente in pozzetti di una piastra a 12 pozzetti dopo il recupero dall'anestesia, al fine di seguire il transito individualmente. Tuttavia, è possibile sottoporre a gavaggio anche gruppi più grandi e valutare il transito a livello di popolazione anziché individualmente. Fare riferimento a Field et al. per le pratiche standard26.
  7. Valutare la motilità intestinale assegnando un punteggio alla posizione più rostrale (o anteriore) delle microsfere fluorescenti nelle larve vive in diversi momenti temporali, utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Anestetizzare brevemente le larve in tricaina 1x (0,017%) e assegnare un punteggio alle zone di localizzazione delle microsfere oppure acquisire immagini da valutare in un secondo momento.
  8. Rappresentare graficamente e confrontare la percentuale di larve totali con microsfere in una determinata regione intestinale nel tempo.

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Risultati

Quando la somministrazione per sondino viene eseguita correttamente, il materiale somministrato dovrebbe essere interamente contenuto nell'intestino anteriore, con scarsa o nulla presenza residua nell'esofago (Figura 3). Il volume somministrato deve essere scelto in modo da essere contenuto nell'ampolla anteriore senza fuoriuscire attraverso la cloaca o l'esofago. Se il volume di materiale o la pressione di somministrazione sono troppo elevati, la forza fisica della somministrazione potrebbe danneggiare ...

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Discussione

In questo studio, descriviamo un nuovo protocollo per la somministrazione diretta di materiali nell'intestino di larve di pesce zebra mediante microsondaggio gastrico. Durante l'intero procedimento, è necessario tenere presente una serie di passaggi critici. In primo luogo, le larve di pesce zebra devono essere in buone condizioni di salute prima dell'esperimento di sondaggio gastrico, per evitare morti non correlate al trattamento. Un altro fattore importante è la qualità dell'ago utilizzato per il sondaggio. Una delle ...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del laboratorio di Rawls per i preziosi suggerimenti sui contenuti e il dottor Alan Fanning per le utili discussioni sulla permeabilità dimensionale delle giunzioni strette e sui metodi di interruzione. Ringraziamo inoltre il dottor Michael Chua e il dottor Neal Kramarcy della Michael Hooker Microscopy Facility per il supporto fornito nell'utilizzo del microscopio confocale. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni degli Istituti Nazionali di Sanità statunitensi T32 DK007737-15 (beneficiario J.L.C.), F32 DK094592 (a J.L.C.) e R01 DK081426 (a J.F.R.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Finquel (metanosulfonato di tricaina)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Anestesia per larve
Soluzione di rosso fenoloSigma-AldrichP0290-100 mlAl 0,5% in DPBS, testata per colture cellulari
Olio minerale, leggero, bianco (alta purezza)AmrescoJ217-500 mlPer riempimento posteriore dell'ago e test del volume
TxRed-Destrano, peso molecolare 10.000, fissabile con lisinaInvitrogen/ Molecular ProbesD-1863Sospensione all'1% in PBS 1x/rosso fenolo
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653Soluzione madre 5 mM in acqua
MetilcellulosaMP Biochemicals0215549590
Capillari in vetro borosilicatoDrummond Scientific3-000-203-G/XDiametro esterno 1,14 mm, diametro interno 0,53 mm, lunghezza 3,5 pollici
Stampo in plastica per la realizzazione di modelliAdaptive Science ToolsTU-1
Unità di microiniezione Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Flaming Brown Micropipette Puller, filamento largo 3,0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330BPreparazione degli aghi
Pinzette studentesche Dumont n. 5Fine Science Tools91150-200,1 x 0,06 mm, per taglio degli aghi
Oculare con graticolo, 5 mm - 100 divisioniLeica10394771Per taglio degli aghi
MicroforgiatriceNarishigeMF-900Taglio degli aghi e lucidatura a fiamma
Ago per siringa Tuberculin SlipTipBecton Dickinson3096261 ml, ago 25G 5/8
Microsfere Fluoresbrite YG (2,0 μm)Polysciences, Inc.18338Analisi della motilità intestinale
Microscopio stereoscopico per dissezioneLeicaS6EProcedura di gavaggio
Microscopio stereoscopico a fluorescenzaLeicaM205CSaggio del barriera con destrano
Microscopio confocaleZeissLSM510Acquisizione di immagini del destrano in circolo

Riferimenti

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

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