Qui sviluppiamo gli strumenti necessari per Ex vivo L'imaging dal vivo di tracciare divisioni cellulari singoli nel topo E8.5 neuroepitelio
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Articolo metodologico
Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato un sistema che integra l'imaging dal vivo di marcatori fluorescenti e fette di coltura embrionale neuroepithelium mouse. Abbiamo approfittato di linee del mouse esistenti per la cellula genetica lineage tracing: una linea di Cre tamoxifene-inducibile e una linea giornalista Cre esprimendo DsRed su ricombinazione Cre-mediata. Utilizzando un livello relativamente basso di tamoxifene, siamo stati in grado di indurre ricombinazione in un piccolo numero di cellule, permettendo di seguire divisioni cellulari individuali. Inoltre, abbiamo osservato la risposta trascrizionale di Sonic hedgehog (Shh) di segnalazione utilizzando un Olig2-eGFP transgenico linea 1-3 e abbiamo monitorato formazione di ciglia infettando la fetta colta con virus che esprime il marcatore di ciglia, SSTR3-GFP 4. Per l'immagine del neuroepitelio, abbiamo raccolto gli embrioni a E8.5, isolato il tubo neurale, montata la fetta neurale in appropriate condizioni di coltura nella camera di imaging e di eseguita time-lapse imaging confocale. Il nostro exmetodo di imaging in vivo in diretta consente di tracciare divisioni cellulari singoli di valutare la relativa tempistica di formazione ciglia primarie e risposta Shh in modo fisiologicamente rilevanti. Questo metodo può essere facilmente adattato utilizzando marcatori fluorescenti distinti e fornisce il campo gli strumenti con cui monitorare il comportamento delle cellule in situ ed in tempo reale.
Protocollo
Topi adulti sono sacrificati per dislocazione cervicale meccanico. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dal IACUC e del Comitato Biosicurezza alla Emory University.
1. Generazione Embryo
- Croce tamoxifene-inducibile Cre linea, CAGGCreER, e la linea giornalista dsRedCre (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) 5,6. Per monitorare la relativa tempistica di risposta Shh nelle cellule figlie, croce CAGGCreER e DsRed linea con il Olig2-eGFP BAC topi transgenici (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figura 1) 7,8.
- Sciogliere tamoxifene in 100% di etanolo, ed es....
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Risultati
Qui abbiamo effettuato ex vivo imaging dal vivo di divisioni cellulari singoli all'interno del E8.5 del mouse neuroepitelio. Per etichettare singole celle, abbiamo indotto ricombinasi Cre in un sottogruppo di cellule contenenti una linea giornalista Cre che esprimevano DsRed upon ricombinazione 5,6 (Figura 3A). Così, 48 ore dopo siamo stati in grado di osservare le divisioni cellulari singoli durante ex vivo imaging (Figure 4A-D). Allo stesso tempo, abbi.......
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Discussione
Il nostro sistema ex vivo permette di osservare direttamente divisioni cellulari singoli all'interno del neuroepitelio in tempo reale via di sviluppo. Come esempio abbiamo esaminato divisioni cellulari entro il mouse embrionale tubo neurale e vigilato o formazione ciglio o risposta Shh. Abbiamo confermato i nostri risultati di imaging (n = 24) erano coerenti con i risultati di sezioni fisse (n = 178) che indicano la nostra tecnica fornisce dati fisiologicamente rilevanti.
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo progetto di ricerca è stata sostenuta da un supplemento ARRA, 5 R01 NS056380. Ulteriore supporto è stato fornito tramite il vettore virale Core e Core Microscopia della Emory Neuroscienze NINDS Nucleo Facilities Grant, P30NS055077. Ringraziamo il mouse Emory transgenico e Gene Targeting Nucleo per derivare la linea di mouse da GENSAT; Greg Pazour per il SSTR3-GFP linea cellulare IMCD3 stabile e Bradley Yoder per il SSTR3-GFP lentivirali costruiamo. Gli anticorpi monoclonali sono stati ottenuti da studi di sviluppo Hybridoma Banca, sviluppato sotto l'egida del NICHD, e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze Biologiche, Iowa City, IA 522....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linea Z/RED (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J | Jackson Laboratory | 005438 | |
| Linea Olig2-eGFP (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd | MMRRC, | 010555-UCD | |
| CAGGCreER | Jackson Laboratory | 003724 | |
| Tamoxifene | Sigma | T5648 | |
| DMEM/F12 (1:1) | GIBCO | 21041-025 | |
| Siero di vitello neonato | Lonza | 14-416F | |
| Penicillina/Streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Siero di ratto SD maschio | Harlan Bioproducts | 4520 | |
| Hepes 1 M | BioWhittaker | 17-737E | |
| L-Glutammina | GIBCO | 21041-025 | |
| Olio minerale leggero | Sigma | M8410 | |
| Lentivirus Sstr3-GFP | Emory Viral Core | ||
| Micro-lama, dimensione 0,025 mm | Electron Microscopy Sciences | 62091 | |
| Piatto in vetro con fondo rivestito in poli-L-lisina da 35 mm | MatTek | P35GC-0-10-C | |
| 100% Vaselina | Kroger | FL9958c | |
| Microscopio confocale invertito a scansione laser A1R | Nikon | ||
| Software NIS Elements | Nikon | ||
| Software 3D Imaris | Bitplane AG | Imaris 7.2.3 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Criostato | Leica | CM1850 | |
| Siero di pecora inattivato per riscaldamento | Invitrogen | 16210-072 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| Tampone fosfato | Prodotto in laboratorio | ||
| Anticorpo monoclonale di ratto anti-RFP (5F8) | Chromotek | 110411 | |
| Siero anti-Arl13b da coniglio | NeuroMab | ||
| anticorpo monoclonale di topo anti-Arl13b 1:5 | NeuroMab | ||
| Anti-Olig2 da coniglio | Chemicon | AB9610 | |
| Anticorpi monoclonali di topo Pax6 | Developmental Hybridoma Bank | Pax6 | |
| Anticorpi monoclonali di topo Shh | Developmental Hybridoma Bank | 5E1 | |
| Anticorpi monoclonali di topo Nkx2.2 | Developmental Hybridoma Bank | 74.5A5 | |
| Ki67 policlonale da coniglio | Abcam | AB15580 | |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 | Molecular Probes | A11031 | |
| Alexa Fluor 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| H–chst | Fisher | AC22989 | |
| TO-PRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| Reagente anti-sbiadimento ProLong Gold | Invitrogen | P36934 |
Riferimenti
- Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
- Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T.
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Ristampe e permessi
