Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per l'ingegneria tissutale

Summary

Qui si descrive una strategia unica per la creazione di matrici biocompatibili, stratificate con interfacce continui tra strati distinti per l'ingegneria tissutale. Tale scaffold in grado di fornire un ambiente ideale personalizzabile per modulare il comportamento cellulare da vari segnali biologici, chimici o meccanici

Abstract

Complesse matrici di coltura di tessuti, in cui tipi e concentrazioni di stimoli biologici (ad esempio fattori di crescita, inibitori, o piccole molecole) o struttura a matrice (ad esempio composizione, concentrazione, o rigidità della matrice) variano nello spazio, consentirebbe un'ampia gamma di indagini riguardo a come queste variabili influenzano la differenziazione cellulare, la migrazione, e altri fenomeni. La sfida principale nella creazione di matrici stratificate è mantenere l'integrità strutturale di interfacce strato senza diffusione di singoli componenti da ogni strato ^1. Attuali metodologie questo comporta in particolare photopatterning ^2-3, litografia ^4, functionalization5 sequenziale, liofilizzazione ^6, microfluidica ^{7, 8} o centrifugazione, molti dei quali richiedono strumentazione sofisticata e competenze tecniche. Altri tramite attacco sequenziale dei singoli strati, che può portare alla delaminazione degli strati ⁹ DGMP supera questi problemi utilizzando un modificatore inerte densità come iodixanolo per creare strati di diversa densità ^10. Poiché il modificatore densità può essere miscelato con qualsiasi prepolimero o molecola bioattiva, DGMP permette ogni strato scaffold da personalizzare. Semplicemente variando la concentrazione del modificatore densità impedisce miscelazione degli strati adiacenti, mentre rimangono acquosa. Successiva polimerizzazione passo comporta una strutturalmente continua scaffold multistrato, in cui ogni strato ha chimico distinto e proprietà meccaniche. Il modificatore di densità può essere facilmente rimosso con risciacquo sufficiente senza perturbazione dei singoli strati o loro componenti. Questa tecnica è particolarmente indicato per la creazione di idrogel di varie dimensioni, forme e materiali.

Un protocollo per la fabbricazione di una 2D-polietilene glicole (PEG) gel, in cui strati alternati incorporano Rgds-350, è descritto di seguito. Usiamo PEG because è biocompatibile e inerte. Rgds, un peptide adesione cellulare ^11, è utilizzato per dimostrare restrizione spaziale di una stecca biologica, e la coniugazione di un fluoroforo (Alexa Fluor 350) permette di distinguere visivamente vari strati. Questa procedura può essere adattato per altri materiali (ad esempio collagene, acido ialuronico, ecc) e può essere esteso per fabbricare gel 3D con alcune modifiche ^10.

Protocol

1. Sintesi di marcato in modo fluorescente Acryloyl-PEG-Rgds

1. Reagiscono con il peptide Rgds acriloil-PEG-succinimidil carbossimetil estere (APEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) e NN diisopropiletilammina (DIPEA) a 1.2:1:2 rapporti molari in dimetilsolfossido (DMSO) sotto argon a temperatura ambiente durante la notte.
2. Confermare coniugazione da matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di volo (MALDI-TOF), spettrometria di massa. Aggiungere 1 ml di APEG-Rgds soluzione di reazione in un punto campione sul target MALDI e asciutto. Preparare una soluzione satura di universale MALDI Matrix in tetraidrofurano (THF) e vortex per 1 min. ~ Aggiungere 1 ml di questa soluzione a punto del campione stesso. Ripetere la procedura per APEG-SCM per il confronto. Caricare e analizzare. Il peso molecolare di APEG-Rgds dovrebbe essere maggiore di APEG-SCM (Figura 2).
3. Di coniugare il fluoroforo, aggiungere una quantità equimolare di Alexa Fluor 350 carbossilico (succinimydyl estere), discioltoin un volume minimo di DMSO, al APEG-Rgds soluzione di reazione da 1,1 e reagire sotto argon a temperatura ambiente per una notte.
4. Purificare APEG-Rgds-350 da dialisi (MW 3500 Da) contro il DI-H ₂ O a 4 ° C per 48 ore a 1.000:1 rapporto volumetrico, lo scambio di dialisato almeno due volte al giorno.
5. Congelare asciugare la purificato APEG-Rgds-350 in Freezone Labconco Plus o Blocco del sistema equivalente a secco e conservare a -20 ° C.

2. Preparazione di uno stampo 2D e Realizzazione di un gel PEG 2D con alternata Rgds-350 Livelli

1. Preparare vetrini idrofobiche. Posizionare vetrini puliti in un piatto di vetro in un forno a vuoto. Riscaldare a 80 ° C per 30 minuti per asciugare completamente le superfici. Luogo piatto con le diapositive in una cappa aspirante e aggiungere 250 microlitri Sigmacote a ogni diapositiva, delicatamente a dondolo per 30 sec alla superficie cappotto intero. Sciacquare i vetrini rivestiti con 100% metanolo, seguita da lavaggio con acqua distillata, ammollo due volte per 5 min in a least 10 ml.
2. Tagliare distanziali in silicone (0,8 mm di spessore) con 10 mm pugni biopsia.
3. Autoclave i distanziali in silicone e Sigmacote trattati con vetrini.
4. Formulare soluzioni per ciascun rispettivo strato in provette per microcentrifuga singoli mescolando PEG diacrilato (PEGda) precursore (concentrazione finale 15% w / v) con diverse quantità di iodixanolo (soluzione stock 60% in acqua) per produrre concentrazioni finali diverse (ad esempio il 40%, 30%, 20% e 10%), che completa il volume residuo di tampone fosfato (PBS) per ottenere soluzioni di densità differenziate. In modo simile, per strati alternati, mix APEG-Rgds-350 (concentrazione finale 8 mm) con iodixanolo e PBS per produrre concentrazioni diverse (ad esempio 35%, 25%, e 15%).
5. Aggiungi fotoiniziatore (2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone, magazzino 333mg/ml in N-vinil pirrolidone) per ogni soluzione per vari strati (10 pl di soluzione madre per ml di ciascuna soluzione di strato). Fotoiniziatore is ultimo aggiunto per prevenire la polimerizzazione prima stratificazione dei gel nello stampo, in quanto è sensibile alla luce.
6. I passi successivi di questo protocollo sarà effettuata in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità.
7. Filtro-sterilizzare ogni soluzione sterile utilizzando una siringa da 1 ml e 0,2 micron. Assemblare l'impostazione stampo intramezzando il distanziatore tra due Sigmacore trattati vetrini e sicure con fascette ponendo come illustrato in Figura 1.
8. Gettare i gel strati aggiungendo la soluzione più densa (es. PEGda con il 40% iodixanolo) prima, seguita da una soluzione meno densa (es APEG-Rgds-350 con 35% iodixanolo). Ripetere la stratificazione alternate per ottenere diversi strati di composizione desiderata e densità come mostrato in Figura 1.
9. Irradiare lo stampo con la luce 365 nm per 3 minuti con un portatile UVR-9000 lampada. Consentire i gel polimerizzati per curare per 5 min. Rimuovere i morsetti, quindi sollevare delicatamente il vetro superiorediapositiva e lo stampo, i gel DGMP stratificate rimarrà nelle diapositive. Utilizzando una spatola sterile, posizionare accuratamente il gel in una provetta da 50 ml contenente PBS sterile o mezzo di coltura per il lavaggio.
10. Lavare il gel polimerizzato in PBS a 1.000:1 rapporto volumetrico, lo scambio di buffer di almeno due volte al giorno per rimuovere il modificatore densità, fotoiniziatore, e polimero che non ha reagito. In alternativa, PBS può essere scambiato con il terreno di crescita. Conservare i gel DGMP in PBS o terreno di coltura per l'esperimento di coltura cellulare indicato al punto 3.
11. Per visualizzare strati alternati, organizzare gel DGMP (questi gel non saranno utilizzabili per colture cellulari) lungo un righello sul vassoio campione del meccanismo di documentazione gel VersaDoc. Esporre i gel a 350 nm, il tempo di esposizione varia a seconda della concentrazione del fluoroforo. Alternando bande scure e blu nell'idrogel DGMP dimostrano formazione di strati distinti di composizione chimica diversa (Figura 3).

3. Colture Cellulari 2D su gel DGMP

1. Per i gel che incorporano peptide Rgds, usare le cellule di adesione dipendenti, ad esempio mioblasti C2C12.
2. Inserire delicatamente gel DGMP (memorizzati in PBS) nei pozzetti di piastre di coltura cellulare a 48 pozzetti utilizzando un raschietto sterile cella in un armadio biosicurezza.
3. Pre-riscaldare terreno di crescita (terreno Eagle modificato da Dulbecco o DMEM supplementato con 10% v / v di siero fetale bovino e 1% v / v 100x soluzione di penicillina-streptomicina) e PBS in un bagno d'acqua a 37 ° C.
4. Lavare una piastra 60% confluenti (10 mm) di C2C12 tre volte con PBS. Aspirare off PBS e cellule raccolto aggiungendo 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 2 min. Risospendere le cellule in mezzo di crescita e cellule di conteggio. Il seme DGMP gel-coltura cellulare contenente bene con mioblasti C2C12 (20.000 cellule / cm ^2). Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO _2/95% di umidità relativa. Delicatamente mezzo di scambio, dopo 4 ore, fare attenzione a non rispostare leggermente cellule aderenti.
5. Dopo 24 ore, il sequestro conservativo di mioblasti C2C12 sui Rgds contenenti strati di gel DGMP può essere confermata da epifluorescenza e microscopia a contrasto di fase (Zeiss Axiovert 200).

Results

MALDI-TOF analisi conferma la coniugazione del peptide ad Rgds acriloil-PEG (Figura 2). Gel di imaging rivela alternata Rgds-350 (blu) dopo la fotopolimerizzazione strati (Figura 3A). Come mostrato in Figura 3A, 2D gel DGMP dimensioni possono variare in base al diametro degli stampi in silicone (10 mm, sinistra, 8 mm, a destra), e pertanto sono facilmente personalizzabile per uso in saggi multipli - in questo caso per adattarsi a 48 pozzetti di piastra di cella (Figura 3B). Epifluorescenza e microscopio a contrasto di fase di mioblasti C2C12 coltivate su un gel DGMP mostra attacco selettivo Rgds-350-strati contenenti PEG (Figura 4), ​​dimostrando compartimentalizzazione del peptide adesione cellulare (Rgds).

Figura 1. Molecolare Weight analisi mediante MALDI-TOF confronto APEG-SCM-APEG Rgds ottenuti dopo la coniugazione del peptide Rgds.

Figura 2. Rappresentazione schematica di fabbricazione DGMP gel. Dopo i gradienti sono stratificati, possono essere autorizzati a stabilirsi per periodi di tempo variabili (t _s) per creare interfacce laureati, seguita da fotopolimerizzazione. Stratificati DGMP gel può essere facilmente estratto dallo stampo per un ulteriore uso. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. A) gel 2D multistrato ottenuti dopo la fotopolimerizzazione ripreso con 350 nm e canali bianchi leggeri di VersaDoc gel documentazione della trasmissione. La scala di grigi rivela strati alternati contenenti Rgds in bianco. B) Inserimento di gel DGMP in piatti cellulari a 48 pozzetti.

Figura 4. Contrasto di fase e l'immagine unita ad epifluorescenza di mioblasti C2C12 coltivate su DGMP gel (scala bar 50 micron).

Figura 5. Effetto della iodixanolo sull'elasticità gel superficie. Atomic microscopia misure di forza di campioni statici di substrati PEG reticolati con metodi stabiliti in precedenza con un trigger 2 nN forza ^12. * P <0,05 e ** p <0,01.

Discussion

DGMP è una semplice strategia per la preparazione di gel multistrato che non si basano su strumenti costosi. Questo protocollo può essere adattato per creare ponteggi utilizzano altri materiali biocompatibili, quali collagene e acido ialuronico. Piccole molecole bioattive, per esempio cellule promotore di adesione peptide Rgds, possono essere legati alla matrice polimerica per evitare miscelazione di segnali tra gli strati. Proteine ​​possono essere incapsulati in strati distinti senza la necessità di coniugazione chimica come, a seconda della dimensione delle maglie della matrice, sono meno inclini a diffondere attraverso idrogel ^10. Qui abbiamo usato iodixanolo (Nycoprep), un modificatore densità inerte, che è stato precedentemente utilizzato per applicazioni di cellule vitali. Modificatori densità altre come saccarosio e destrosio può anche essere usato. Variando il tempo di assestamento (t _s), è possibile mettere a punto le interfacce tra i due strati per produrre transizioni morbide o taglienti, se necessario (tempo più lungo assestamento dà transizioni più uniformi) ^{10. Per esempio, fluide transizioni tra strati di gel DGMP potrebbe essere utilizzato per generare un gradiente continuo di una stecca biologica per studiare processi cellulari come chemiotassi.}

L'effetto del modificatore densità sulla rigidità gel è mostrato in Figura 5 per un 15% aPEGda gel; una caratterizzazione più completa di rigidità e di porosità in funzione della concentrazione e PEGda iodixanolo attualmente è sottoposto. Mentre la concentrazione PEGda in questo esempio è relativamente elevato, abbiamo osservato un modulo elastico maggiore del 60% in gel con il 30% rispetto al iodixanolo senza gel. La variazione rigidità gel può essere regolata per modulando la concentrazione macromero o densità di reticolazione.

Abbiamo anche applicato la tecnica DGMP creare 3D multistrato utilizzando gel di poliacrilammide e precursori PEG ^10. Variando la concentrazione e il grado di reticolazione del prepolimero consente variazione strutturaleponteggi, che possono essere usati per esplorare il comportamento cellulare come la crescita e la migrazione polarizzata in 3D.

In sintesi, DGMP è una tecnica adattabile che può essere applicato a fabbricare scaffold 2D e 3D da una varietà di materiali biocompatibili per un'ampia gamma di applicazioni di ricerca biomedica e di base.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente o dello strumento	Azienda	Numero di catalogo
Polietilene glicole succinimydyl carbossimetil (a-PEG-SCM)	Laysan	120-64
Polyethelyene glicol diacrilato (PEGda)	Dajac Labs	9359
Arginina-Glicina-Acido aspartico-serina (Rgds)	American Peptide	49-01-4
N, N - Diisopropiletilammina (DIPEA)	Sigma	D125806
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma	D2438
N, N-dimetilformammide (DMF)	Pescatore	D119-4
Tetraidrofurano (THF)	Pescatore	T397
Dialisi cassetta (3500Da)	Thermo Scientific	66330
Alexa Fluor 350 carbossilico succinimydyl	Life Technologies	A-10.168
Sigmacote	Sigma	SL2
Distanziali in silicone	Grainger	1MWA4
Biopsia pugni	Acuderm	P1025 (10 mm) P850 (8 mm)
Fosfato di Dulbecco tamponata salina (DPBS)	Hyclone	SH30028
Iodixanolo (NycoPrep)	Pescatore	NC9388846
2-idrossi-4'-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone	Sigma	410896
Mezzo di Dulbecco Eagle modificato (DMEM)	Life Technologies	11054
Siero fetale bovino	Life Technologies	10082
Penicillina-streptomicina	Life Technologies	15140
Mioblasti C2C12	ATCC	CRL-1772
MALDI	Bruker	N / A
UVR-9000	Bayco	UVR-9000
VersaDoc	Bio-Rad	N / A