Articolo metodologico

LeafJ: un plugin per ImageJ semi-automatico di misurazione Leaf Shape

DOI:

10.3791/50028

⸱

21 gennaio 2013

 ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, University of California Davis

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Dimostrazione di metodi chiave per le misurazioni ad alta foglia di throughput. Questi metodi possono essere utilizzati per accelerare la fenotipizzazione foglia nello studio di molte piante mutanti o comunque impianti di vagliatura da fenotipo foglia.

Abstract

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Fenotipizzazione High throughput (phenomics) è un potente strumento per collegare i geni alle loro funzioni (leggi l'articolo 1 e recenti esempi 2-4). Foglie sono l'organo fotosintetica primaria, e la loro dimensione e la forma variano evolutivamente e ambientalmente nell'impianto. Per queste ragioni gli studi sulla morfologia delle foglie richiedono la misurazione di parametri multipli da numerose foglie, che è meglio fare da strumenti phenomics semi-automatici 5,6. Ombra Canopy è un importante spunto ambientale che colpisce l'architettura vegetale e storia di vita, la suite di risposte è la denominazione collettiva di evitare la sindrome di tonalità (SAS) 7. Tra le risposte SAS, ombra indotta allungamento foglia picciolo e le variazioni di area di lama sono particolarmente utili come indici 8. Ad oggi, i programmi a foglia (ad esempio SHAPE 9, LAMINA 10, LeafAnalyzer 11, LEAFPROCESSOR 12) in grado di misurare e classificare i contorni foglia forma delle foglie, Ma non può emettere lunghezza picciolo. La mancanza di sistemi su larga scala di misura di piccioli fogliari ha inibito approcci phenomics a SAS di ricerca. In questo articolo, si descrive un plugin di nuova concezione ImageJ, chiamato LeafJ, che possono rapidamente misurare la lunghezza picciolo ei parametri lama foglia della pianta modello Arabidopsis thaliana. Per la foglia occasionale che la correzione manuale richiesta del picciolo / foglie confine lama abbiamo usato un touch-screen tablet. Inoltre, cellule forma di foglia e il numero di cellule foglia sono importanti determinanti della dimensione del foglio 13. Separata da LeafJ si presentano anche un protocollo per l'utilizzo di un touch-screen tablet per misurare la forma delle cellule, l'area e dimensione. Il nostro sistema di foglia tratto di misurazione non si limita alla prevenzione ombra di ricerca e accelererà fenotipizzazione foglia di mutanti e piante di screening di fenotipizzazione foglia.

Protocollo

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1. Materiali vegetali

Si noti che questo protocollo la crescita delle piante è destinato per rilevare evitare risposta ombra. È possibile coltivare le piante sotto la condizione preferita.

  1. Cospargere semi di Arabidopsis thaliana in materia di acqua filtri di carta imbevuti di 9 centimetri piastre di Petri e conservare (stratificare) li a 4 ° C per quattro giorni al buio.
  2. Trasferire queste piastre di Petri per condizioni di sole simulato: 80-100 μE radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) e molto rosso supplemento di portare la R: rapporto FR a 1,86. Condizioni di utilizzo giorno lungo (16 ore di luce / 8 ore buio) e la temperatura costante di 22 ° C. Incubare in questa condizione per tre giorni per permettere ai semi di germinare.
  3. Trasferimento seme germogliato nel terreno e mantenere le piante in condizioni di Dom Per esperimenti su larga scala, si consiglia di preparare i tag piccoli per l'etichettatura di ogni impianti utilizzando dati Gestore stampa unione in Microsoft Word 2004 (o successivo) per la produzione di etichette.
  4. Undici giorni dopo il transfer al suolo, spostare la metà degli impianti a condizione tonalità: come sole, ma con supplemento di far-luce rossa per portare la R / FR rapporto a 0,52.
  5. Dopo altre dodici giorni, le piante sono pronte per l'imaging foglia. In questa fase le foglie più vecchie ancora del tutto sviluppato, mentre giovani foglie sono in fase di espansione, in modo da catturare un'istantanea di sviluppo. Si consiglia di scegliere un orario diverso di sviluppo a seconda delle esigenze.

2. Catturare le immagini Leaf sezionato

  1. Preparare lucidi etichettati con genotipo vegetale e condizioni di crescita con cinque cornici rettangolari. Un frame corrisponde alle foglie di una pianta. Microsoft Excel può essere utilizzato per stampare una griglia coerente con etichette.
  2. Staccare le foglie di 26 giorni vecchi impianti.
  3. Scansione lascia a 600 dpi su un scanner piano. Notare che parte da un impianto deve essere posizionato verticalmente all'interno di una finestra nera in un sandwich di fogli trasparenti. Evitare di toccare le foglieal telaio di una finestra nera e foglie sovrapposte, che darà errori nelle procedure seguenti.

3. Foglia Image Analysis per LeafJ

  1. Scarica ImageJ Trascinare il file LeafJ.jar nella cartella plugins di ImageJ.
  2. Aprire un file di immagine in ImageJ 1.45s o versioni successive 14.
  3. Dividere l'immagine in tre canali di colore (rosso, verde e blu) da "Immagine a colori> Canali> Split" e applicare la soglia per l'immagine nel canale blu.
  4. Selezionare tutte le foglie da una pianta con uno strumento rettangolo (Figura 1A).
  5. Selezionare "LeafJ" dal menu plugin.
  6. Selezionare informazioni di annotazione per questa pianta dalla finestra di dialogo che appare. È possibilemodificare i valori di default che appaiono qui cliccando su "modificare queste opzioni".
  7. Dopo l'esecuzione di plug LeafJ e prima di fare clic su "OK", modificare le linee tracciate dalla regione di interesse (ROI) window manager (se necessario Figura 1B). Un touch-screen tablet (come un iPad) è utile per questa procedura. iPads può essere collegato ad un computer come un monitor esterno utilizzando il software di visualizzazione Air.
  8. Esportare i risultati di misura e le informazioni associate (i nomi dei file, tempo di fioritura, che si disgregano per, misurati dai, ecc) per Microsoft Excel o software equivalente.

4. Foglia Image Analysis cella in ImageJ

  1. Fissare sezionato lascia come descritto nel riferimento 15 dopo la scansione (fase 2). Foglie FAA fissi possono essere conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi.
  2. Eliminare le foglie modificando fissativo FAA per cloralio idrato soluzione e foglie incubare per 1 ~ 2 ore prima osservazione al microscopio 15.
  3. Monte foglie mimicroscopio scorre con tricomi rivolto verso l'alto. Utilizzando ingrandimento 40x su un microscopio composto, strato mesofillo immagine del del centro di ogni foglia su entrambi i lati della vena principale, evitando cellule vicine tricomi o venature.
  4. Cella foglia Trace delinea da strumento di ImageJ gestore ROI con l'aiuto del touch-screen tablet e uno stilo (come descritto al punto 3). Analisi delle immagini cellulare utilizza le funzioni integrate di ImageJ, ma non richiede LeafJ.

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Risultati

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1. Immagini Leaf Mostra stime del picciolo e Blade Boundary foglia, e la loro finestra di misura

Una delle caratteristiche più utili di LeafJ è il rilevamento automatico della foglia lama / picciolo confine (Figura 1). L'algoritmo LeafJ funziona come segue: la funzionalità incorporata ImageJ ParticleAnalyzer viene utilizzata per individuare e determinare l'orientamento delle foglie all'interno della selezione dell'utente. Per ciascuna anta la larghezza della fog...

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Discussione

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Il nostro plugin "LeafJ" consente la misurazione della lunghezza picciolo semi-automaticamente, aumentando il throughput quasi 6 volte misurazione manuale. Lunghezza Picciolo è un indice importante della SAS ed è anche un punto di riferimento di altri fenomeni, come la resistenza sommersione e la crescita hyponastic 17. Pertanto questo plugin può essere utile per una vasta gamma di ricercatori vegetali.

Il nostro plugin è implementato in una ben consolidata java basato s...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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LeafJ è stato scritto da JNM mentre era in anno sabbatico nel laboratorio del Dr. Katherine Pollard presso gli Istituti Gladstone.

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (numero di licenza IOS-0923752).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo
lontano luce rossa del LED Orbitec su misura
trasparenza IKON HSCA / 5
scanner Epson Epson Perfection V700 Photo
Immagine J NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ costume http://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Aria di visualizzazione Avatron Software Inc. blank "> http://avatron.com/
iPad2 Apple Inc. http://www.apple.com/

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
  2. Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
  3. Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
  4. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
  5. Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570(2012).
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  8. Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
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  10. Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82(2008).
  11. Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
  12. Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
  13. Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
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  15. Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
  16. Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
  17. Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).

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