Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Sommario

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

Abstract

L'uso del tabacco porta a numerosi problemi di salute, tra cui il cancro, malattie cardiache, enfisema, e ictus. Dipendenza da fumo di sigaretta è un disturbo neuropsichiatrico prevalente che deriva dalle azioni biofisici e cellulari della nicotina sui recettori nicotinici (nAChR) in tutto il sistema nervoso centrale. Comprendere i vari sottotipi nAChR esistenti in aree cerebrali importanti per la dipendenza da nicotina è una delle principali priorità.

Esperimenti che impiegano tecniche elettrofisiologiche, come cellula intera o patch clamp a due elettrodi registrazioni voltage clamp sono utili per la caratterizzazione farmacologica dei nAChR di interesse. NAChRs cellule esprimenti, come cellule di mammifero o di coltura tissutale oociti di Xenopus laevis, sono fisicamente isolata e sono quindi facilmente studiato utilizzando gli strumenti della moderna farmacologia. Molti progressi sono stati fatti utilizzando queste tecniche, in particolare quando il recettore bersaglio era già noto unnd espressione ectopica è facile da realizzare. Spesso, tuttavia, è necessario studiare nAChR nel loro ambiente nativo: in neuroni in fettine cerebrali acutamente raccolti da topi o ratti di laboratorio. Ad esempio, i topi che esprime "ipersensibili" subunità nAChR come topi α4 L9'A ¹ e topi α6 L9'S ^2, consente l'identificazione univoca dei neuroni in base alla loro espressione funzionale di una subunità nAChR specifico. Sebbene cellule intere registrazioni di patch clamp da neuroni in fettine di cervello è fatto di solito dal elettrofisiologo esperto, è difficile da applicare localmente farmaci come acetilcolina o la nicotina alla cella di registrare, in una sezione del cervello. Diluizione dei farmaci nella superfusate (applicazione bagno) non è rapidamente reversibile, e U-tube sistemi non si adattano facilmente a lavorare con fettine di cervello.

In questo articolo, si descrive un metodo per la rapida applicazione di nAChR-attivazione farmaci neuroni registrati in pazienti adulti mOuse fettine di cervello. Standard di cellule intere registrazioni sono fatte da neuroni in fettine, e una micropipetta secondo riempito con un farmaco di interesse viene manovrata in posizione vicino alla cella registrata. Una iniezione di aria compressa o azoto inerte nella droga-riempita pipetta provoca una piccola quantità di soluzione di farmaco ad essere espulso dalla pipetta sulla cella registrata. Usando questo metodo, nAChR mediati correnti possono essere risolti con precisione millisecondo. Tempi di applicazione del farmaco può essere facilmente variata, e il farmaco-riempita pipetta può essere retratto e sostituita con una nuova pipetta, consentendo curve concentrazione-risposta per la creazione di un singolo neurone. Sebbene descritta nel contesto di nAChR neurobiologia, questa tecnica dovrebbe essere utile per studiare molti tipi di ligando canali ionici o recettori nei neuroni da fettine cerebrali.

Protocollo

1. Preparazione di soluzioni per la preparazione del cervello Slice ed Elettrofisiologia

1. Soluzioni per la preparazione di fette di cervello precedentemente descritte ^{3, 4.} Preparare N-metil-D glucammina (NMDG) basata taglio e soluzione di recupero della seguente composizione (in mM): 93 N-metil-D glucammina, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucosio, 5 Na ⁺ ascorbato, tiourea 2, 3 Na piruvato ^+, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Portare a 300-310 mOsm con NMDG. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 10 N HCl.
   1. S....

Risultati

Nei nostri esperimenti, abbiamo regolarmente registrare da dopamina (DA) alla produzione di neuroni dell'area ventrale tegmentale (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNC). In voltage-clamp modalità di applicazione di pressione di acetilcolina o nicotina a queste cellule in genere come risultato un rapido, corrente catione attivo che raggiunge picco entro 100-200 msec (Figura 1A-B). Decadimento della corrente in larga misura dalla diffusione del farmaco dal sito di azione, e se enzimi nella fetta.......

Discussione

Il metodo presentato in questo articolo è ampiamente utile per studiare ligando funzione di canale ionico nella preparazione fetta del cervello. Tuttavia, ci sono un certo numero di fattori che influenzano significativamente la qualità e la riproducibilità dei dati sperimentali che derivano da utilizzando questo metodo. Per esempio, le correnti evocate sono molto sensibili al diametro della punta della pipetta farmaco-riempita. Piccoli consigli causerà difficoltà con espulsione della soluzione di farmaco, e le punte di .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo
N-metil-D glucammina	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glucosio	Sigma	G5767
Na + Ascorbato	Sigma	A4034
Tiourea	Sigma	T8656
Na + Piruvato	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Pharmaceuticals	76351315
Gluconato di potassio	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 vibrante affettatrice	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming / Brown micropipetta estrattore	Sutter
Camera di RC-27 Registrazione	Warner
TC-344B perfusione regolatore riscaldamento	Warner	640101
SH-27B soluzione di riscaldamento	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD Videocamera	Hamamatsu
Picospritzer III	Generale Valve Co.
MP-285 Micromanipolatore	Sutter
PA-100 traduttore piezoelettrico	Piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplificatore	Piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp.