Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Sommario

Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Abstract

Divisione cellulare batterica richiede il montaggio coordinato di più di dieci proteine ​​essenziali alla midcell ^1,2. Centrale di questo processo è la formazione di un anello simile sovrastruttura (Z-ring) dalla proteina FtsZ al piano di divisione ^3,4. La-Z anello costituito da più singolo filamento protofilamenti FtsZ, e comprendere la disposizione dei protofilamenti all'interno Z-ring fornirà sul meccanismo di Z-ring e la sua funzione di generatore di forza ^5,6. Questa informazione è rimasta inafferrabile a causa delle limitazioni attuali convenzionale microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Microscopia a fluorescenza convenzionale non è in grado di fornire una immagine ad alta risoluzione di Z-ring a causa del limite di diffrazione della luce (~ 200 nm). Electron cryotomographic di imaging ha rilevato sparsi protofilamenti FtsZ in piccole C. cellule crescentus ^7, ma è difficile da applicare a grandi cellule qualiE. coli o B. subtilis. Qui si descrive l'applicazione di un metodo di risoluzione super-microscopia a fluorescenza, microscopia localizzazione fotoattivati ​​(PALM), per caratterizzare quantitativamente l'organizzazione strutturale della E. coli Z-ring ^8.

PALM offre sia immagini alta risoluzione spaziale (~ 35 nm) e un'etichettatura specifica per consentire l'identificazione univoca delle proteine ​​bersaglio. Abbiamo etichettato FtsZ con il mEos2 fotoattivabile proteina fluorescente, che passa da verde a fluorescenza (eccitazione = 488 nm) al rosso fluorescenza (eccitazione = 561 nm) in caso di attivazione a 405 nm ^9. Durante un esperimento PALM, singoli FtsZ-mEos2 molecole sono stocasticamente attivati ​​e le corrispondenti posizioni centroide delle singole molecole sono determinati con <20 nm precisione. Un super-risoluzione di immagine di Z-ring viene poi ricostruita sovrapponendo le posizioni centroide di tutti i rilevati FtsZ-mEos2 molecole. <p class = "jove_content"> Usando questo metodo, abbiamo trovato che la Z-anello ha una larghezza fissa di circa 100 nm ed è composto da un fascio di allentato protofilamenti FtsZ che si sovrappongono tra loro in tre dimensioni. Questi dati forniscono un trampolino per ulteriori indagini modifiche ciclo cellulare dipendenti della Z-ring ¹⁰ e può essere applicata ad altre proteine ​​di interesse.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Inoculare i terreni LB con una singola colonia di ceppo JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Crescere durante la notte in uno shaker a 37 ° C.
2. Diluire la cultura 1:1000 in M9 ⁺ minimi di media [Sali M9, 0,4% di glucosio, 2 mM _MgSO4, 0.1 mM CaCl _2, Acidi MEM aminoacidi e vitamine] e crescere fino a metà-log fase (OD ₆₀₀ = 0,2-0,3) in presenza di cloramfenicolo (150 mcg / ml) a temperatura ambiente (RT).
3. Indurre la cultura con 20 mM IPTG per 2 ore (vedi nota n ° 1).
4. Cultura pellet in microcentrifuga (8000 rpm, 1 min) e risospendere in un....

Risultati

Illustrato in Figura 3Aiv è bidimensionale, super-risoluzione resa del Z-ring generato dal metodo di imaging PALM descritto sopra. Qui di seguito, riassumiamo informazioni qualitative e quantitative che possono essere ottenuti da esse.

Qualitativamente, abbiamo osservato che la Z-ring è una struttura irregolare che adotta più configurazioni (singola banda o arco elicoidale) che non sono distinguibili in tradizionali immagini di fluorescenza (confronta Figura 3A-Dii

Discussione

Immagini PALM contengono informazioni sui conteggi molecola e posizioni all'interno di una cella, consente un'analisi dettagliata della distribuzione e la disposizione delle molecole proteiche bersaglio che è difficile da ottenere con altri mezzi. Di seguito si evidenzieranno le precauzioni che dovrebbero essere prese per estrarre informazioni quantitative precise, pur mantenendo la rilevanza biologica delle immagini PALM. Abbiamo anche esplorare le informazioni che possono essere meglio ottenuta utilizzando cel.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
50 x MEM Aminoacidi	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamine	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% paraformaldeide	Electron Micrsocopy Scienze	15.710-S
SeaPlaque GTG agarosio	Lonzo	50111
50 nm Oro Perle	Microsfere-Nanosfere	790113-010
FCS2 Imaging Camera	Bioptechs
Fase Adattatore	ASI	I-3017
Microscopio invertito	Olimpo	IX71
NA 1,45, 60x Obiettivo	Olimpo
IXON EMCCD Camera	Andor Tecnologia	DU897E
488 nm Sapphire Laser	Coerente
561-nm Sapphire Laser	Coerente
405-nm Laser CUBE	Coerente