Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

Summary

Una tecnica che utilizza alta risoluzione intavital microscopia a 2 fotoni di visualizzare direttamente e quantificare filtrazione gloemrular in glomeruli superficie. Questo metodo consente la determinazione diretta di caratteristiche di permeabilità di macromolecole in stati sia normali e malati.

Abstract

Malattie renali con perdita urinaria di grandi macromolecole essenziali, quali albumina sierica, sono stati a lungo pensato per essere causato da alterazioni nella permeabilità della barriera composto podociti, cellule endoteliali vascolari, e una membrana basale lavorano all'unisono. I dati ottenuti nel nostro laboratorio utilizzando intravital microscopia a 2 fotoni rivelato una più permeabile barriera di filtrazione glomerulare (ULA) di quanto si pensasse in condizioni fisiologiche, con il recupero di filtrato albumina che si verificano in un sottoinsieme precoce di cellule chiamate cellule del tubulo prossimale (PTC) ^{1,2, 3.}

Tecniche precedenti usate per studiare filtrazione renale e stabilendo la caratteristica della barriera di filtrazione coinvolto micropuntura del lume di questi segmenti tubolari primi con campionamento del fluido contenuto e analisi ^4. Questi studi determinata concentrazione di albumina nel fluido luminale essere praticamente inesistenti; corrispondente strettamentea quanto normalmente rilevata nelle urine. Tuttavia, la caratterizzazione dei polimeri di destrano con dimensioni definite da questa tecnica ha rivelato quelle di dimensioni simili all'albumina sierica avevano livelli più elevati nel lume tubulare e nelle urine; suggerendo un aumento della permeabilità ^5.

Qui è una descrizione dettagliata della tecnica utilizzata per visualizzare direttamente e quantificare glomerulare fluorescente permeabilità albumina in vivo. Questo metodo permette di individuare filtrata albumina attraverso la barriera di filtrazione nello spazio di Bowman (la camera iniziale di filtrazione urinaria), e permette anche la quantificazione di albumina riassorbimento dai tubuli prossimali e visualizzazione di successiva transcitosi albumina ^6. L'assenza di fluorescenza lungo albumina successivi segmenti tubolari in rotta alla vescica evidenzia l'efficienza del percorso di recupero nei segmenti tubulo prossimale precedenza. Inoltre, quando è stata applicata questa tecnica per determinare la permeabilitàdi destrani aventi dimensioni simili a valori di permeabilità praticamente identiche albumina sono stati segnalati ^2. Queste osservazioni supportano direttamente la necessità di ampliare l'attenzione di molte malattie renali proteinuriche ai inclusi alterazioni delle cellule del tubulo prossimale bonifica.

Protocol

1. Coniugazione di Rat albumina sierica di solfo-rodamina 101 Sulfonyl Cloruro (Texas Red)

1. Sciogliere 100 mg di albumina sierica Rat (RSA) in 6,667 ml di 100 mM Sodio bicarbonato pH 9,0; concentrazione finale di 15 mg / ml in un tubo da 50 ml conica.
2. Soluzione luogo in bicchieri di ghiaccio / acqua e raffreddare a tra 0-4 ° C.
3. Aggiungere 200 ml di dimetilformammide anidra di alta qualità (DMF) per una fiala 10 mg di Texas Red Sulfonyl Cloruro (TRSC); vortice sul medio per 15 sec.
4. Soluzione Vortex RSA sul medio e aggiungere il TRSC sciolto.
5. Wrap 50 ml conica in lamina (Parafilm può essere utilizzato per assicurare una....

Results

La figura 3 mostra un esempio di immagine presa da un glomerulo superficie di un Munich Wistar Frömter ratto e le misure adottate per determinare la permeabilità di albumina fluorescente. Il valore GSC per l'albumina di 0,0111 derivato per questo autunno glomerulo individuo all'interno del campo visto in questo ceppo di Monaco ratti Wistar quando nella condizione alimentato ^3. La stabilità visto in queste immagini è dovuta alla accurata progettazione e l'esecuzione di istruzioni raffigurati n.......

Discussion

I passaggi evidenziati qui rappresentano ciò che sentiamo di essere quelli che producono valori di permeabilità coerenti e precise, perché aggirano i seguenti problemi:

1. Scattering: L'uso di un rosso fluorofori che emettono permetterebbe una maggiore efficienza di raccolta della luce dal più fotoni di lunghezza d'onda sono meno inclini a disperdersi. Utilizzando sia fluorofori che emettono verdi o blu introdurrà maggiore variazione in GSC della causa della maggiore variabilità nei valori di intensità.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio confocale/multi-fotone Olympus Floview 1000	Olympus America		Filtri per rivelatori: Blu 430/100, Verde 525/50, Rosso 605/90
Mode-Locked Ti:Zaffiro Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Lunghezze d'onda di eccitazione regolabili: ~750-1150 nm
Fotorivelatori di fosfuro di arseniuro di gallio	Hamamatsu Corp		Nota: Disponibili configurazioni a montaggio frontale o laterale.
Metamorph Software di elaborazione delle immagini	Dinamica		Nota: Versione 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007
versione Manipolazione Pinze Microscopia	elettronica Scienze	Cat# 78266-04
Mayo Forbici da dissezione Microscopia	elettronica Scienze	Cat# 72962
CA Micro forbici Modello 1C300	Scienze della microscopia elettronica	Cat# 78180-1C3
Kelly Pinze emostatiche (dritto)	Scienze della microscopia elettronica	Cat# 72930
Coperta per giacca d'acqua + cuscinetto riscaldante	Gaymar		T/Pompa PN 11184-000 Coperta-66N111CC
Repti-Therm sotto il riscaldatore del serbatoio	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Gatto # T-353
Siero di ratto Albumina	Sigma Aldrich	Gatto # A-6272
DMF anidro di alta qualità	Sigma Aldrich	Gatto # 270547
Nastro per autoclave Strate-Line	Fisher Scientific	Cat # 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dish (50 mm / 40 mm coverslip)	Microscopia elettronica Scienze	Cat # 70665-07