C. elegans Chemiotassi Assay

Summary

Un metodo di valutazione quantitativa della risposta chemiotattica dei Caenorhabditis elegans È descritto. Un indice chemiotattico (CI) è stato impiegato come un modo per valutare con precisione la risposta dei vermi a determinati obiettivi, e servire da piattaforma di confronto tra i ceppi e composti di interesse.

Abstract

Molti organismi utilizzare chemiotassi a cercare fonti di cibo, evitare sostanze nocive, e trovare compagni. Caenorhabditis elegans è impressionante comportamento chemiotassi.

La premessa dietro testare la risposta dei vermi a un odorizzante è quello di metterli in una zona e osservare il movimento evocata in risposta a un odorizzante. Anche con i molti saggi disponibili, ottimizzando verme partendo posizione rispetto sia al controllo e aree di test, minimizzando l'interazione di vermi con l'altro, pur mantenendo dimensioni significative campione rimane un lavoro in corso ^1-10. Il metodo qui descritto mira a risolvere questi problemi modificando il saggio sviluppato da Bargmann et al. ^1. Una capsula di Petri è diviso in quattro quadranti, due quadranti opposti contrassegnati "Test" e due sono designati "Control". Anestetico viene posto in tutti i test e siti di controllo. I vermi sono collocati nel centro del piatto con un circle segnato attorno all'origine per garantire che i vermi non mobili saranno ignorati. Utilizzando un sistema a quattro quadranti piuttosto che uno o due 2 1 elimina polarizzazione nel movimento dei vermi, come sono equidistanti dai campioni di prova e di controllo, indipendentemente da quale lato della provenienza cominciarono. Questo aggira il problema di vermi essere costretti a viaggiare attraverso un cluster di altri worm per rispondere a un odorizzante, che può ritardare vermi o costringerli a prendere un percorso più tortuoso, ottenendo una interpretazione non corretta del loro percorso previsto. Questo metodo presenta anche vantaggi pratici da avere un campione più ampio e che consente al ricercatore di eseguire il test incustodito e segnare i vermi una volta che il tempo a disposizione è scaduto.

Introduction

Ward primo sviluppato il saggio di chemiotassi nel 1973 ^5, e da allora ha avuto vasta portata delle applicazioni. Neurobiologia è un campo che ha beneficiato di utilizzare una varietà di saggi di chemiotassi. Adattamento olfattivo, una semplice forma di apprendimento e memoria, è stata dimostrata in C. elegans utilizzando saggi di chemiotassi ^6. Essi sono stati utilizzati anche per dimostrare che C. elegans possono sviluppare tolleranza etanolo-un risultato che dimostra non solo la plasticità comportamentale dei vermi, ma che mostra anche che i vermi possono essere molto utile nello studio della dipendenza umana ^3. I....

Protocol

1. Preparazione / lavaggio dei Worms

1. Sincronizzare i vermi a giovane adulto ^11.
2. Pipettare 2 ml di basale S su una piastra 5 cm Chemiotassi di scena vermi che hanno appena eliminato il prato di OP50 E. coli. Inclinare la piastra come necessario per garantire i vermi vengono lavati dalla superficie della piastra nel buffer.
3. Pipettare 1 ml della soluzione Basal verme-S in una provetta da microcentrifuga.
4. Centrifugare per 10 secondi utilizzando un PicoFuge a 6.600 giri al minuto.
5. Aspirare il basale S, lasciando il pellet di vermi indisturbati.
6. Aggiungere 1 ml di soluzione S basale alla prove....

Results

Confrontando wild-type (N2) C. elegans alla ODR-10 (KY10) mutante.

Abbiamo usato diacetile, un noto C. elegans chemiotattico, confrontare vermi tipo selvatico a quello di un mutante che manca il recettore per diacetile ^1,12. Per tipo selvatico (N2) vermi l'indice chemiotattico era 0.100 ± 0.066 per l'etanolo, e 0,839 ± 0,031-0,5% diacetile. Come previsto, diacetile provoca una risposta chemoattractive significativo da worm wild-type (p <.......

Discussion

Chemiotassi, anche se controllato da un complesso insieme di meccanismi neuronali e cellulari, può essere facilmente e oggettivamente quantificato utilizzando saggi di chemiotassi. Per ottenere i migliori risultati da saggi, alcuni passaggi critici devono essere prese. In primo luogo, mettendo in scena i vermi è essenziale per produrre risultati sperimentali coerenti. Worms in diverse fasi della vita comportano in modo diverso ^13; worm stage in modo misto può risultati sperimentali skew. In secondo luogo, gar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- colesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K fosfato di potassio buffer, pH 6.0; dH2O fino a 1 litro.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopi	Leica
Di sezione	Leica
Pipetta P1000	Gilson
Pipetta P10	Gilson
0.5 M Azido di Sodio
Agaro Chemotaxis [1,6% BBL-agar (Benton-Dickinson) o 2% Difco-agar. Autoclave. Aggiungere 5 mM fosfato di potassio, pH 6,0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Etanolo/Acqua Distillata
Compost Test (ad es. 0,5% diacetile)
Agaro	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0,25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531