Il seguente protocollo fornisce tecniche per l'incapsulamento pancreatiche β-cellule in fase di crescita PEG-peptide idrogel formati da tiolo-ene foto-click reazioni. Questa piattaforma materiale non solo offre un microambiente cytocompatible per l'incapsulamento delle cellule, ma anche controllato dall'utente consente un rapido recupero delle strutture cellulari formano all'interno dei idrogel.
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Articolo metodologico
Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli idrogel sono polimeri reticolati idrofili che forniscono un microambiente tridimensionale con tessuto-come elasticità ed elevata permeabilità per coltura di cellule o tessuti terapeuticamente rilevanti. Idrogel preparati da poli (etilene glicole) (PEG) derivati sono sempre più utilizzati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale, in parte a causa delle loro proprietà e cytocompatible sintonizzabili. In questo protocollo, abbiamo utilizzato tiolo-ene-step crescita photopolymerizations per fabbricare PEG-peptide idrogel per incapsulare pancreatica MIN6 b-cellule. I gel sono stati formati da 4-braccio PEG-norbornene (PEG4NB) e un macromero chimotripsina sensibile reticolante peptide (CGGYC). La natura idrofila e non-fouling di PEG offre un microambiente cytocompatible per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare in 3D, mentre l'utilizzo di chimotripsina-sensitive sequenza peptidica (C GGY ↓ C, freccia indica sito di clivaggio enzimatico, mentre cisti terminaleeine residui sono stati aggiunti per tiolo-ene reticolazione) permette un rapido recupero di costruzioni cellulari che formano all'interno del idrogel. Il seguente protocollo elabora tecniche per: (1) Incapsulamento di MIN6 β-cellule nel tiolo-ene idrogel, (2) analisi qualitativa e quantitativa della vitalità cellulare per determinare la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, (3) Recupero di sferoidi cellulari usando chimotripsina-mediata gel erosione, e (4) Analisi strutturale e funzionale degli sferoidi recuperati.
Introduzione
Gli idrogel sono idrofili polimeri reticolati con un potenziale eccezionale come materiali ponteggi per la riparazione e la rigenerazione dei tessuti. 1-3 L'alto contenuto di acqua degli idrogel permette facile diffusione di ossigeno e di scambio di nutrienti e prodotti del metabolismo cellulare, che sono tutti fondamentale per mantenere la vitalità cellulare. Inoltre, gli idrogel sono vettori eccellenti per rilascio controllato e consegna cellulare dovuta loro sintonizzabilità alta. 2 idrogel sintetici come quelli preparati da poli (etilene glicole) (PEG) sono sempre più utilizzati in applicazioni di ingegneria tissutale, soprattutto a caus....
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Protocollo
A. macromero e sintesi peptidica
- Sintetizzare 4 bracci PEG-norbornene (PEG4NB) e litio arylphosphanate fotoiniziatore (LAP) utilizzando protocolli stabiliti. 18,19
- Sintetizzare bis-cisteina contenente chimotripsina sensibile peptide C CGGY ↓ (freccia indica sito di taglio della chimotripsina) con standard di sintesi peptidica in fase solida in un sintetizzatore di peptidi a microonde (CEM Discover SPS).
- Calcolare la quantità di resina (resina Rink amide-MBHA) richiesta in base al rapporto di sostituzione della resina e la scala di sintesi. Rigonfiare la resina in dimetilformammide (DMF) in un recipiente di reazi....
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Risultati
Figure 1-4 Mostra risultati rappresentativi per l'incapsulamento, la sopravvivenza, la proliferazione, la formazione di sferoide, e il recupero sferoidale in tiolo-ene idrogel. Figura 1 mostra lo schema di reazione (1) fase di crescita tiolo-ene fotopolimerizzazione con PEG4NB e CGGYC, e ( 2) l'erosione chimotripsina gel mediata che segue un meccanismo di erosione superficiale. figure 2 e 3, i risultati ottenuti con la vitalità presenti co.......
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Discussione
Il protocollo descritto presenta dettagli facile incapsulamento di cellule in tiolo-ene idrogel formati da passo-crescita fotopolimerizzazione. Mentre un rapporto stechiometrico di 1:1 di norbornene a tiolo gruppi funzionali è stato utilizzato in questo protocollo, il rapporto può essere regolata a seconda delle esperienze. Oltre a una corretta formulazione, è importante mantenere omogeneità nella pre-polimero soluzione. In particolare, utilizzare pipettaggio delicato per garantire che le cellule sono ben distribuite ne.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato finanziato dal NIH (R21EB013717) e IUPUI OVCR (RSFG). L'autore ringrazia la signora Han Shih per la sua assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| 4 bracci PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amminoacidi | Anaspec | ||
| Live / Dead cella kit vitalità | Invitrogen | L3224 | Include Calcein AM e etidio omodimero-1 |
| AlamarBlue reagente | ABD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagente | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Senza Ca +2 e Mg +2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | SenzaCa +2 e Mg +2 |
| Alta glucosio DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotico-antimicotica | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Tripsina-free α-chimotripsina | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin kit ELISA | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml siringa monouso | BD Biosciences |
Riferimenti
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative....
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Ristampe e permessi
