Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

Sommario

Le caratteristiche meccaniche del glicocalice endoteliale sono state misurate utilizzando sfere indentazione micron di dimensioni su cantilever AFM. Le cellule endoteliali sono state coltivate in una camera personalizzata in condizioni fisiologiche di flusso per indurre l'espressione glicocalice. I dati sono stati analizzati utilizzando un modello di pellicola sottile per determinare lo spessore glicocalice e modulo.

Abstract

Nostra comprensione dell'interazione dei leucociti e la parete del serbatoio durante la cattura dei leucociti è limitata da una non completa comprensione delle proprietà meccaniche dello strato di superficie endoteliale. È noto che molecole di adesione sui leucociti sono distribuite in modo non uniforme rispetto alla superficie topografia ^3, che limita la formazione topografia adesivo legame con altre superfici ^9, e che le forze di contatto fisiologici (≈ 5,0-10,0 pN per microvillus) può comprimere i microvilli come meno un terzo della loro lunghezza a riposo, aumentando l'accessibilità di molecole alla superficie opposta ^{3, 7.} Consideriamo l'endotelio come struttura a due strati, il corpo cellulare relativamente rigido, più il glicocalice, un rivestimento morbido zucchero protettivo sulla superficie luminale ^6. E 'stato dimostrato che il glicocalice può agire come una barriera per ridurre l'adesione dei leucociti al ⁴ superficie endoteliale.In questa relazione si comincia ad affrontare la deformabilità delle superfici endoteliali per capire come la rigidità meccanica endoteliale potrebbe influenzare la formazione del legame. Le cellule endoteliali in coltura statica non esprimono un glicocalice robusta, ma le cellule cresciute in condizioni di flusso fisiologiche cominciano ad approssimare il glicocalice osservate in vivo ^2. Il modulo del corpo cellulare endoteliale è stata misurata utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM) da circa 5 a 20 kPa ^5. Lo spessore e la struttura del glicocalice sono stati studiati mediante microscopia elettronica ^8, e il modulo del glicocalice è stato calcolato utilizzando metodi indiretti, ma a nostra conoscenza, non ci sono stati rapporti pubblicati di una misura diretta del modulo glicocalice in cellule viventi . In questo studio, presentiamo indentazione esperimenti effettuati con una nuova sonda AFM sulle cellule che sono state coltivate in condizioni di massimizzare la loro espressione di glicocalice make misurazioni dirette del modulo e lo spessore del glicocalice endoteliale.

Protocollo

1. Metodi

1,1 Cella camera di flusso

Una camera di flusso, illustrato in figura 1, è stato costruito in modo che le cellule possono essere coltivate in un taglio di 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ e poi trasferita direttamente a un AFM Asylum MFP3D (Santa Barbara, CA).

1. La camera di flusso è stato preparato per l'esperimento prima pulizia dei vetrini in soluzione Piranha (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ per 15 min e poi lavando con acqua distillata. Essi sono stati poi cotto a secco e rivestita con trietossi amminopropil silano (APTES) in una camera ....

Risultati

In un esperimento tipico, 20 forza-vs-distanza curve sono state ottenute da una data regione della cellula, tipicamente nella regione perinucleare, vicino, ma non, il nucleo (entro ~ 2 micron). Le curve sono state allineate per tenere conto di qualsiasi deriva campione per tutta la durata della misurazione e poi mediati per rimuovere il rumore cantilever, come mostrato in Figura 4. Le curve sono state analizzate e forma con il modello a due strati che è stato sviluppato per la determinazione del modulo .......

Discussione

Abbiamo usato valori calcolati dal modello a due strati e teoria Hertz per modellare l'interazione di un leucociti circolanti nel sangue con la parete endoteliale. Abbiamo calcolato che un microvillus sulla leucociti con un diametro di 50 nm sotto un carico di 10 pN sarebbe trattino circa 150 nm nel glicocalice, solo una frazione dello spessore totale. Ciò indica che il glicocalice, con proprietà misurate in questo esperimento, è una barriera significativa interazione cellula-cellula e può essere un grande ostacolo .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo di McCoy	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Cellule endoteliali terreno di crescita	Vec Technologies	MCDB-131
Pool umani ombelicale cellule endoteliali Vena	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Acido solforico	JT Baker	9681-02
Perossido di idrogeno	VWR	BDH3742-1
(3-amminopropil) triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Alcool isopropilico	VWR	BDH8999-4
Tripsina	Cellgro	25-054-C1
Sale di Hank soluzione tamponata	Gibco	14175-095
solfo-NHS-LC-biotina	Thermo Scientific	21335
Streptavadin perline	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Mensole Tipless	Nanomondo	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Gomma di silicone	Stockwell elastomeri	SE50-RS
30 ml Siringhe	Benton Dickinson	309650
Calibro 18 aghi	Benton Dickinson	305196
Set di estensione	Hospira	4429-48
4 vie	Teleflex	W21372
Maschio / femmina Port Caps	Smith Medical	MX491B
Pompa peristaltica	Watson-Marlow	401U / D
Tubi peristaltica	Watson-Marlow	903.0016.016
filtri sterili	Pall Life Science	4652