Qui si descrive una tecnica ottimizzata per la produzione di alta qualità di vitamina A / complesso RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare una nave da trasporto vitamina da STRA6, il recettore RBP.
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Articolo metodologico
Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine plasmatiche Retinol Binding
In questo articolo
Sommario
Abstract
La vitamina A è essenziale per la visione e la crescita / differenziazione di quasi tutti gli organi umani. Plasma Retinol Binding Protein (RBP), è il principio e il supporto specifico di vitamina A nel sangue. Qui si descrive una tecnica ottimizzata per produrre e purificare olo-RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare il trasporto di vitamina A per il recettore ad alta affinità RBP STRA6. La prima tecnica permette di produrre una grande quantità di alta qualità holo-RBP (100%-caricato con retinolo) per la vitamina A saggi trasporto. RBP di alta qualità è essenziale per saggi funzionali perché misfolded RBP comunicati vitamina A contaminazione batterica prontamente e in preparazione RBP può causare artefatti. In tempo reale, come le tecniche di monitoraggio elettrofisiologico hanno dato un contributo critico agli studi di trasporto di membrana. Il recettore-mediata RBP trasporto retinolo non è stato analizzato in tempo reale fino a poco tempo. La seconda tecnica qui descritta è la ragionel analisi in tempo STRA6-catalizzata rilascio retinolo o il carico. La terza tecnica è analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto retinolo da olo-RBP di proteina cellulare che si lega al retinolo (CRBP-I). Queste tecniche offrono l'elevata sensibilità e risoluzione nel rivelare recettore della vitamina RBP di un meccanismo di assorbimento.
Introduzione
La vitamina A è una molecola organica che è essenziale per la sopravvivenza umana e il corretto funzionamento di quasi tutti gli organi umani. Derivati della vitamina A (retinoidi) partecipare a diversi eventi biochimici e cellulari tra cui il rilevamento della luce per 1,2 visione e la regolazione dell'espressione genica e della traduzione di proteine durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti 3-6. Sebbene retinolo ha la capacità di diffondere sistemica, evoluzione avvicinò con proteine plasmatiche retinolo legante, una proteina carrier specifico per la vitamina A trasporto nel sangue per ottenere alta efficienza e specificit....
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Protocollo
1. Produzione, ripiegamento, e Purificazione HPLC di Holo-RBP
- Trasforma BL-21cells con il vettore pET3a ospitare il cDNA per RBP umano con la sua etichetta 6x sulla N-terminale. Crescono le trasformate BL-21 celle in un agitatore a 37 ° C in media ml 40 LB con carbenicillina fino OD a 600 nm raggiunge 0,5. Indurre l'espressione della proteina RBP con l'aggiunta di 1 mM IPTG a. Crescere i batteri a 37 ° C un altro 5 ore.
- RBP prodotto in E. coli è presente soprattutto nei corpi di inclusione insolubili. Per arricchire corpi inclusi, cellule pellet a 10.000 xg per 20 min. Seguito da sonicazione le cellule su ghiaccio in 5 ml di PBS ....
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Risultati
Presentiamo qui i risultati rappresentativi per olo-RBP produzione e purificazione mediante HPLC (Figura 1), analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata rilascio retinolo da olo-RBP e carico retinolo in apo-RBP (Figura 2) e analisi in tempo reale di STRA6-catalizzata retinolo trasporto da olo-RBP per EGFP-CRBP-I (Figura 3).
Senza ripiegamento, RBP prodotta in batteri è quasi completamente misfolded per la presenza di numerosi legami disolfur.......
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Discussione
Condividiamo qui un protocollo ottimizzato di produzione RBP perché RBP procedure di produzione e di purificazione sono fondamentali per la generazione di RBP correttamente piegato. Data la possibilità di specie RBP misfolded e la presenza di tracce di proteine batteriche anche in HPLC purificato batteri-RBP prodotte, è utile utilizzare RBP nativa da siero per confermare una conclusione relativa a RBP. RBP urina, che è disponibile in commercio, è una miscela complessa di molte specie di RBP tra apo-RBP e olo-RBP .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Supportato da National Institutes of Health di sovvenzione R01EY018144.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| guanidina cloridrato | EMD | 5010 | |
| cistina | Sigma | C8755 | |
| cisteina | Sigma | C7352 | |
| EDTA | Pescatore | BP118-500 | |
| Tris | Pescatore | 7786-1 | |
| DTT | EMD | 3860 | |
| retinolo | Sigma | R7632 | |
| carbenicillina | Pescatore | BP2648-5 | |
| IPTG | EMD | 5810 | |
| PBS | EMD | 6508 | |
| NaCl | Pescatore | BP358-10 | |
| Ni-NTA | Qiagen | 1018244 | |
| imidazolo | EMD | 5720 | |
| eptano | EMD | HX0295-1 | |
| Blocker caseina | Perforare | 37528 | |
| Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO10 K) | Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor-2 Piastra | Pescatore | 14-245-177 | |
| Hamilton siringa a tenuta di gas # 1710 | Pescatore | 14-824-655 |
Riferimenti
- Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
- Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential ther....
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Ristampe e permessi
