È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

13.1K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/50169

⸱

28 gennaio 2013

 ,  , 
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

Qui si descrive una tecnica ottimizzata per la produzione di alta qualità di vitamina A / complesso RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare una nave da trasporto vitamina da STRA6, il recettore RBP.

Abstract

La vitamina A è essenziale per la visione e la crescita / differenziazione di quasi tutti gli organi umani. Plasma Retinol Binding Protein (RBP), è il principio e il supporto specifico di vitamina A nel sangue. Qui si descrive una tecnica ottimizzata per produrre e purificare olo-RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare il trasporto di vitamina A per il recettore ad alta affinità RBP STRA6. La prima tecnica permette di produrre una grande quantità di alta qualità holo-RBP (100%-caricato con retinolo) per la vitamina A saggi trasporto. RBP di alta qualità è essenziale per saggi funzionali perché misfolded RBP comunicati vitamina A contaminazione batterica prontamente e in preparazione RBP può causare artefatti. In tempo reale, come le tecniche di monitoraggio elettrofisiologico hanno dato un contributo critico agli studi di trasporto di membrana. Il recettore-mediata RBP trasporto retinolo non è stato analizzato in tempo reale fino a poco tempo. La seconda tecnica qui descritta è la ragionel analisi in tempo STRA6-catalizzata rilascio retinolo o il carico. La terza tecnica è analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto retinolo da olo-RBP di proteina cellulare che si lega al retinolo (CRBP-I). Queste tecniche offrono l'elevata sensibilità e risoluzione nel rivelare recettore della vitamina RBP di un meccanismo di assorbimento.

Introduzione

La vitamina A è una molecola organica che è essenziale per la sopravvivenza umana e il corretto funzionamento di quasi tutti gli organi umani. Derivati ​​della vitamina A (retinoidi) partecipare a diversi eventi biochimici e cellulari tra cui il rilevamento della luce per 1,2 visione e la regolazione dell'espressione genica e della traduzione di proteine ​​durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti 3-6. Sebbene retinolo ha la capacità di diffondere sistemica, evoluzione avvicinò con proteine ​​plasmatiche retinolo legante, una proteina carrier specifico per la vitamina A trasporto nel sangue per ottenere alta efficienza e specificità e per evitare la tossicità associata con diffusione casuale 7-10. Un recettore ad alta affinità che si lega alla RBP e riprende vitamina A è stato ipotizzato nel 1970 11-13. Nonostante le prove accumulate in tre decenni l'esistenza del recettore RBP 14-31, l'ipotesi del recettore è stata discussa per molti anni a causa della existence di una definizione errata di olo-RBP. La corretta definizione di holo-RBP è che è l'alta affinità complesso 1:1 fra retinolo e RBP. Estrazione ripetuta di olo-RBP di solvente organico è necessario per la produzione di apo-RBP. Questa definizione è utilizzata da quasi tutti i laboratori che studiano RBP 7,9,32-35 o il recettore RBP 14-31,36-42. La definizione errata di olo-RBP, che è stato utilizzato per confutare l'esistenza del recettore RBP è la miscela acuta di retinolo libero con apo-RBP. Poiché la funzione del recettore RBP di vitamina A assorbimento da olo-RBP è quello di rilasciare retinolo da olo-RBP, il recettore RBP avrebbe giocato alcun ruolo nella captazione retinolo se retinolo è libero di cominciare (come proposto dalla definizione errata di holo -RBP).

La recente identificazione del recettore RBP come una proteina di dominio multitransmembrane chiamato STRA636 e la sua funzione di assorbimento di vitamina A da olo-RBP 36-43 sostiene con forza contro l'ipotesi che RBP nonbisogno di un recettore per fornire vitamina A. dettagliate analisi ha rivelato che STRA6 ha 9 domini transmembrana con l'N-terminale extracellulare e situati C-terminale situati intracellularmente 40. Situato tra transmembrana 6 e 7 è un dominio di legame essenziale RBP 39. STRA6 è accoppiato sia LRAT e CRBP-I di vitamina A assorbimento da olo-RBP, ma né LRAT né CRBP-I è assolutamente necessaria per una maggiore attività STRA6 41. STRA6 capacità di catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP è la chiave per la sua attività di assorbimento di vitamina A 41. Facendo affidamento su STRA6 per rilasciare il suo retinolo, vitamina A consegna entro il RBP in grado di trasportare la vitamina A per colpire le cellule nei tessuti periferici, con elevata specificità ed efficienza.

L'importanza cruciale di olo-RBP definizione e la preparazione è dimostrata non solo dal dibattito storico sulla esistenza del recettore RBP, ma anche da tre documenti relativi recenti basate su olo-RBP definizioni difdifferenti dalla definizione originale e corretta 44-46. Il primo documento utilizzato l'olo-RBP definizione che è stato utilizzato per disapprovare l'esistenza del recettore RBP per studiare il recettore RBP 44. I documenti secondo e terzo avvicinò con una terza definizione di holo-RBP che ha reso ancora meno probabile per retinolo essere studiati per formare un complesso con adeguata RBP 45,46. Questi studi preparato tre H-retinol/RBP mescolando olo-RBP (nemmeno apo-RBP) con 3 H-retinolo. Poiché questo dosaggio non ha avuto 3 H-retinol/RBP formata e non rimuovere eventuale eccessivo 3 H-retinolo 45,46, non è un saggio per 3 H-retinolo assorbimento da 3 H-retinol/RBP, ma è un libero 3 H-retinolo diffusione dosaggio. E 'stato dimostrato in precedenza che STRA6 non aumenta l'assorbimento cellulare di retinolo libero da LRAT 38 o CRBP-I 41. Praticamente tutti retinolo è associato RBP nel sangue e non vi è rilevabile free retinolo. Una delle principali funzioni del recettore RBP è catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP durante l'assorbimento retinolo da olo-RBP 41. Se il retinolo è artificialmente rilasciato o è in forma libera per cominciare 45,46, il recettore RBP non è necessaria. I risultati notevolmente diversi ottenuti dal test gratuito diffusione retinolo rispetto alle analisi basate su preparato correttamente olo-RBP dimostrano che una corretta preparazione di RBP è di fondamentale importanza per i suoi saggi funzionali.

RBP può essere purificata da siero umano 41, ma il procedimento è complesso e la resa è bassa. Un approccio alternativo è quello di produrre RBP in E. coli. Perché E. coli non ha la capacità di piegamento corretto mammiferi proteine ​​secrete con più di una coppia di legami disolfuro come RBP, è essenziale RBP ripiegare e purificare la proteina correttamente ripiegata. Proteine ​​mal ripiegate non solo si comportano diversamente da correggere RBP piegato in vari metodi,ma anche causare aggregazione di proteine ​​durante la conservazione. Per la stessa ragione, apo-RBP viene prodotta solo da alta qualità olo-RBP. Descriviamo qui un protocollo ottimizzato per la produzione di RBP di alta qualità 100% loaded con retinolo attraverso l'espressione batterica, ripiegamento, e la purificazione HPLC. Purificazione HPLC non solo rimuove RBP piegato in modo non corretto, ma anche significativa la contaminazione batterica che può causare artefatti gravi se RBP è utilizzato in saggi di trasduzione del segnale. Abbiamo anche descrivere due sensibili in tempo reale tecniche di monitoraggio per lo studio dei trasporti retinolo STRA6. Entrambe le tecniche dipendono RBP alta qualità. Per motivi di spazio, le tecniche classiche di vitamina radioattivo a base di retinoidi e HPLC-based A dosaggi di assorbimento non sono descritte qui.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Produzione, ripiegamento, e Purificazione HPLC di Holo-RBP

  1. Trasforma BL-21cells con il vettore pET3a ospitare il cDNA per RBP umano con la sua etichetta 6x sulla N-terminale. Crescono le trasformate BL-21 celle in un agitatore a 37 ° C in media ml 40 LB con carbenicillina fino OD a 600 nm raggiunge 0,5. Indurre l'espressione della proteina RBP con l'aggiunta di 1 mM IPTG a. Crescere i batteri a 37 ° C un altro 5 ore.
  2. RBP prodotto in E. coli è presente soprattutto nei corpi di inclusione insolubili. Per arricchire corpi inclusi, cellule pellet a 10.000 xg per 20 min. Seguito da sonicazione le cellule su ghiaccio in 5 ml di PBS con inibitori della proteasi, seguiti da 2 cicli di gelo e disgelo. Pellet giù i corpi di inclusione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet in ghiaccio.
  3. Solubilizzare l'inclusione corpo pellet per sonicazione in 10 ml 7,5 M guanidina cloridrato. Aggiungere un volume di mezzo (5 ml) di tampone Tris 25 mM, pH 9,0 e DTT ad una finale concentration di 10 mM. Agitare vigorosamente soluzione in un vortex per una notte a temperatura ambiente per ridurre completamente e denaturare le proteine.
  4. Centrifugare la soluzione proteica per rimuovere il materiale insolubile a 18.000 xg per 20 min a 4 ° C. Dopo la rotazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta e posizionare il tubo in ghiaccio.
  5. Preparare quattro volumi (60 ml) di tampone di ripiegatura (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cistina, cisteina 3,0 mM, EDTA 1 mM). Degassare il buffer ripiegatura. Preparare anche 600 microlitri 10 mM in etanolo retinolo sotto fioca luce rossa. Conservare al buio in ghiaccio. Sia la soluzione tampone di ripiegamento e retinolo devono essere preparati al momento.
  6. Raffreddare sia la soluzione proteica e il buffer ripiegamento su ghiaccio per almeno 30 min. Temperature più alte riduce probabilmente la qualità della ripiegato RBP. Aggiungere 1 ml di tampone di ripiegamento goccia a goccia e 10 ul di soluzione retinolo, mentre a sua volta soluzione proteica è vigorosamente miscelato in un becher su ghiaccio. Ripetere questa operazione fino a quando tutti buffer di ripiegamento e retinolovengono aggiunti. Tenere agitazione la reazione in ghiaccio, al buio per 5 ore.
  7. Centrifugare la reazione di ripiegatura a 24.000 xg per 30 min a 4 ° C. È essenziale eliminare gli aggregati subito dopo la reazione di ripiegatura.
  8. Concentrare la soluzione supernatante utilizzando Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO 10 K) a circa 10 ml. Non concentrare la soluzione ripiegato più di questo livello. Concentrarsi troppo porterà alla aggregazione proteica e riduce la resa finale e la qualità della RBP correttamente piegato. Diluire il campione concentrato con PBS freddo a 100 ml. Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere i componenti della reazione di ripiegatura che interferiscono con la purificazione nickel.
  9. Centrifugare la soluzione ancora una volta a 24.000 xg per 20 min a 4 ° C. È importante rimuovere qualsiasi precipitato. Trasferire il supernatante in due provette da 50 ml, ciascuna contenente 1 ml di Ni-NTA slurry che è stato lavato con PBS. Ruotare le provette a 4 ° C per un'ora. Incubazione f una soluzione diluita dio 1 hr può causare la precipitazione di proteine ​​mal ripiegate che devono essere rimossi.
  10. Centrifugare le provette a 500 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante con attenzione. Galleggiante Tutto deve essere rimosso. Aggiungere PBS freddo a 30 ml per ciascun tubo. Filare di nuovo e rimuovere il surnatante. Ripetere questo processo fino a quando non vedi nulla, ma perle nel tubo.
  11. Trasferire la resina Ni-NTA ad una colonna vuota. Lavare resina con 20 volumi di colonna di imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM in PBS. Eluire His-RBP in 5 volumi di colonna di 100 mM imidazolo in PBS. Non conservare questa soluzione per un periodo prolungato di tempo, e congelamento riduce la resa e la qualità finale. Per ottenere risultati ottimali, RBP purificare mediante HPLC immediatamente.
  12. Dializza His-RBP purificato dalla resina Ni-NTA contro 25 mM Tris, pH 8,4, e 120 mM NaCl. Un concentratore può essere utilizzato anche per lo scambio di buffer. Campioni chiari per HPLC mediante centrifugazione a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C a destra prima di ogni corsa.
  13. Purificare holo-RBP su HPLC utilizzando uno ioneColonna di scambio AX-300 da un gradiente di NaCl passo (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, e 1.000 mm 15 min) con 25 mM Tris, pH 8,4 come fase mobile ad 1 ml / min. Con l'aumento della concentrazione di NaCl, holo-His-RBP viene rilasciato mentre apo-RBP e misfolded RBP rimanere legato alla colonna (Figura 1). Se refolding RBP non avviene in modo ottimale, misfolded RBP (es misfolded RBP-I in Figura 1) può predominare l'intera preparazione.
  14. Ripristinare il corretto piegato olo-RBP dalle frazioni di picco a 360 mM di NaCl. Monitorare attentamente il profilo di eluizione correttamente piegato e misfolded His-RBP. A partire da 1000 mM di NaCl, la maggior parte di misfolded His-RBP dovrebbero essere liberati.
  15. Le frazioni contenenti holo-RBP sono riunite, concentrate, e dializzata contro PBS a 4 ° C. Verificare la resa finale e la qualità (330 nm/280 nm) da spettrofotometro. Prodotto correttamente piegati dovrebbe avere un rapporto nm/280 330 nm di poco superiore a 1 (Figura 1).
  16. Per produzionee apo-RBP, aggiungere un volume uguale di eptano al purificato olo-RBP e mescolare delicatamente ruotando la notte a 4 ° C. Centrifugare a 16.000 g per 10 min a 4 ° C e trasferire accuratamente la fase acquosa inferiore in una nuova provetta (evitando il precipitato all'interfaccia). Ripetere il processo per tre volte con una incubazione per 3 ore ciascuno. Controllare l'assorbimento di uno spettrofotometro Nanodrop per assicurarsi che il picco di 330 nm è scesa al livello di fondo.

2. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata Retinolo rilascio e Retinolo Caricamento in corso

  1. Bloccare un nero 96 pozzetti Microfluor-2 piastra (Thermo Scientific) con 200 pl di Blocker Casein (Pierce) notte a 4 ° C per prevenire il bloccaggio aspecifica di holo-RBP alla plastica. Blocker caseina dà l'effetto migliore blocco dei tutte le soluzioni di blocco che abbiamo testato.
  2. Membrane preparate da cellule esprimenti STRA6 o cellule di controllo sono lavate con PBS e attraverso una siringa Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 volte per produrre una sospensione uniforme in PBS. Usiamo tipicamente membrane derivati ​​da 1/100 a 1/20 di cellule cresciute su un piatto di 100 mm per reazione.
  3. Lavare i pozzetti della Microfluor-2 piastra una volta con 200 microlitri di PBS. Raffreddare la piastra sul ghiaccio prima aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto).
  4. Monitoraggio in tempo reale di retinolo fluorescenza viene misurata con l'ottica di fluorescenza della Omega Polarstar (BMG Labtech) con il 320EX filtro di eccitazione e il filtro per le emissioni 460-10. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1.800. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione.
  5. Per iniziare l'analisi retinolo rilascio, i pozzetti vengono letti una sola volta con l'endpoint di lettura mode prima olo-RBP (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore. Per avviare il saggio retinolo carico, all-trans retinolo (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti in fioca luce rossa. La piastra viene letta una volta prima apo-RBP viene aggiunto a 0 min. Appena apo-RBP viene aggiunto, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore.
  6. Dopo che tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (ad esempio mostrato in Figura 2) dal software Omega Data Analysis (BMG Labtech) in Microsoft Excel per l'analisi dei dati. Ciascun punto di tempo genera un file che contiene le letture di tutte le condizioni sperimentali. Ad esempio, se ci sono 20 punti di tempo, consolidare i 20 file in un unico file di Excel per l'analisi dei dati.
  7. Per l'analisi dei dati, i segnali di fluorescenza prima dell'aggiunta di retinolo o holo-RBP a 0 min sono considerati segnali di fondo und sottratti dai segnali finali fluorescenza a tutti i tempi. Sebbene i segnali di fondo sono bassi rispetto alla fluorescenza in retinolo olo-RBP, sottraendo il fondo elimina l'influenza aspecifica di dispersione della luce dalle membrane e permette di concentrarsi sulla fluorescenza retinolo di holo-RBP o retinolo aggiunta a 0 min.

3. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto di retinolo da Holo-RBP a CRBP-I

  1. Retinolo-EGFP è un nuovo trasferimento di risonanza di fluorescenza (FRET), coppia che è stata recentemente istituita 41. STRA6-catalizzata trasporto retinolo da olo-RBP per EGFP-CRBP-I è monitorata in tempo reale misurando retinolo-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I proteina di fusione con 6XHis tag (EGFP-CRBP-I) viene prodotto in cellule di mammifero e viene purificata su resina Ni-NTA prima dell'esperimento. EGFP-CRBP-I possono essere memorizzati in PBS con inibitori della proteasi per un breve periodo di tempo a 4 ° C. Alternativamente la proteina di fusione is congelati in -80 ° C in piccole aliquote.
  2. Prima che le reazioni, preparare una bloccato Microfluor-2 piastra e membrane come descritto sopra. Lavare i pozzetti della piastra Microfluor-2 una volta con 200 microlitri di PBS prima dell'aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto).
  3. In tempo reale retinolo-EGFP FRET è misurata utilizzando Polarstar Omega con l'eccitazione 320EX filtro e i filtri di emissione 460-10 e 510-10 con simultanei duello di emissione ottica di fluorescenza. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1800 per canale. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione.
  4. Per avviare le reazioni, EGFP-CRBP-I (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti. La piastra viene letta sullace si utilizza la modalità di lettura Endpoint prima olo-RBP è aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente dalla misurazione ogni 5-10 minuti per 1-2 ore.
  5. Dopo tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (esempio mostrato in Figura 3) dal software Omega analisi dei dati per Microsoft Excel per l'analisi dei dati come descritto sopra.
  6. Retinolo-EGFP FRET è calcolata la variazione dinamica del rapporto delle accettore / donatore picchi di emissione 47. L'equazione 41 per calcolare questo rapporto è [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], dove t 510, 510 b, t 460, e 460 b rappresentano le emissioni a 510 nm dopo l'inizio della reazione ( t = tempo di punto), a 510 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), a 460 nm dopo l'inizio della reazione (tempo t = punto), ed a 460 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), rispettivamente.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Presentiamo qui i risultati rappresentativi per olo-RBP produzione e purificazione mediante HPLC (Figura 1), analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata rilascio retinolo da olo-RBP e carico retinolo in apo-RBP (Figura 2) e analisi in tempo reale di STRA6-catalizzata retinolo trasporto da olo-RBP per EGFP-CRBP-I (Figura 3).

Senza ripiegamento, RBP prodotta in batteri è quasi completamente misfolded per la presenza di numerosi legami disolfur...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Condividiamo qui un protocollo ottimizzato di produzione RBP perché RBP procedure di produzione e di purificazione sono fondamentali per la generazione di RBP correttamente piegato. Data la possibilità di specie RBP misfolded e la presenza di tracce di proteine ​​batteriche anche in HPLC purificato batteri-RBP prodotte, è utile utilizzare RBP nativa da siero per confermare una conclusione relativa a RBP. RBP urina, che è disponibile in commercio, è una miscela complessa di molte specie di RBP tra apo-RBP e olo-RBP ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Supportato da National Institutes of Health di sovvenzione R01EY018144.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente / materiale Azienda Numero di catalogo Commenti
guanidina cloridrato EMD 5010
cistina Sigma C8755
cisteina Sigma C7352
EDTA Pescatore BP118-500
Tris Pescatore 7786-1
DTT EMD 3860
retinolo Sigma R7632
carbenicillina Pescatore BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Pescatore BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazolo EMD 5720
eptano EMD HX0295-1
Blocker caseina Perforare 37528
Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 Piastra Pescatore 14-245-177
Hamilton siringa a tenuta di gas # 1710 Pescatore 14-824-655

Riferimenti

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10(2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Recettore STRA6Purificazione di Holo-RBPFluorescenza in tempo realeSaggio di rilascio del retinoloSaggio di caricamento del retinoloAnalisi FRETPurificazione HPLCRefolding proteico
Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.