Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

Sommario

Descriviamo un metodo per quantificare l'attività delle ATPasi di tipo P che controtrasportano K⁺ mediante l'espressione eterologa degli enzimi negli ovociti di Xenopus e misurando l'assorbimento di Rb⁺ o Li⁺ nelle singole cellule mediante spettrofotometria di assorbimento atomico. Il metodo è un'alternativa sensibile e sicura agli esperimenti di flusso di radioisotopi, facilitando studi cinetici complessi.

Abstract

Mentre il trasporto cationico da parte del trasportatore elettrogenico di membrana Na⁺,K⁺-ATPasi può essere misurato mediante elettrofisiologia, l'H⁺,K⁺-ATPasi gastrica che opera in modo elettroneutro è più difficile da studiare. Molti test di trasporto utilizzano radioisotopi per ottenere un rapporto segnale/rumore sufficiente, tuttavia, le misure di sicurezza necessarie impongono severe restrizioni per quanto riguarda l'esposizione umana o la progettazione dei saggi. Inoltre, il trasporto di ioni attraverso le membrane cellulari è influenzato in modo critico dal potenziale di membrana, che non è direttamente controllato nelle colture cellulari o nelle preparazioni di proteoliposomi. Qui, sfruttiamo l'eccezionale sensibilità della spettrofotometria di assorbimento atomico (AAS) verso tracce di elementi chimici per misurare il trasporto di Rb⁺ o Li⁺ da parte di Na⁺,K⁺- o H⁺,K⁺-ATPasi gastrica in singole cellule. Utilizzando gli ovociti di Xenopus come sistema di espressione, determiniamo la quantità di Rb⁺ (Li⁺) trasportata nelle cellule misurando campioni di omogenati di singoli ovociti in un dispositivo AAS dotato di un forno atomizzatore di grafite (THGA) riscaldato trasversalmente, caricato da un autocampionatore. Poiché il background dell'assorbimento di Rb⁺ non specifico negli ovociti di controllo o durante l'applicazione di inibitori ATPasi-specifici è molto piccolo, è possibile implementare complessi schemi di saggi cinetici che coinvolgono un gran numero di condizioni sperimentali contemporaneamente, o confrontare la capacità di trasporto e la cinetica di trasportatori mutati sito-specifici con elevata precisione. Inoltre, poiché l'assorbimento cationico è determinato su singole cellule, gli esperimenti di flusso possono essere eseguiti in combinazione con il voltage-clamping (TEVC) a due elettrodi per ottenere un controllo accurato del potenziale e della corrente di membrana. Ciò ha permesso, ad esempio, di determinare quantitativamente la stechiometria di trasporto 3Na⁺/2K⁺ della Na⁺,K⁺-ATPasi e ha permesso per la prima volta di studiare la dipendenza dal voltaggio del trasporto cationico da parte dell'H⁺,K⁺-ATPasi gastrica che opera in modo elettroneutro. In linea di principio, il test non è limitato alle proteine di membrana che trasportano il K⁺, ma può funzionare altrettanto bene per affrontare l'attività dei trasportatori di metalli pesanti o di transizione, o l'assorbimento di elementi chimici da parte di processi endocitotici.

Introduzione

Volevamo sviluppare un'alternativa sensibile, sicura ed economica agli esperimenti con traccianti radioattivi per studiare l'attività di trasporto specifica delle proteine di membrana che traslocano ioni al fine di aggirare le restrizioni riguardanti l'accesso ai laboratori isotopici, i requisiti di sicurezza o l'uso di costosi radioisotopi, che - come nel caso del litio - potrebbero anche non essere disponibili a causa dei tempi di decadimento estremamente brevi. Eravamo particolarmente interessati a determinare l'attività dell'H⁺,K⁺-ATPasi gastrica che opera in modo elettroneutro, perché l'enzima non genera corrente e la sua attività non può quindi essere affrontata con metodi elettrofisiologici. Poiché Na⁺,K⁺- e H⁺,K⁺-ATPasi trasportano Rb⁺ efficiente quanto K⁺ (e anche Li⁺), l'elevata sensibilità della tecnica AAS per il rubidio o il litio dovrebbe facilitare il rilevamento sensibile dell'attività di trasporto. Gli spettrofotometri ad assorbimento atomico sono dispositivi analitici comuni, ampiamente distribuiti nei laboratori chimici e dovrebbero essere accessibili a un gran numero di scienziati interessati. Inoltre, abbiamo voluto sfruttare il sistema di espressione degli ovociti Xenopus, che utilizza grandi cellule singole (circa 1,0-1,5 mm di diametro) che consentono di ottenere una variabilità da cellula a cellula notevolmente bassa per quanto riguarda il livello di espressione proteica all'interno di un singolo lotto. Un semplice calcolo dimostra la fattibilità del test AAS: il limite di rilevabilità (massa caratteristica) per il rubidio con la tecnica THGA-AAS è di 10 pg o 1,2·^10-13 mol (Rb: 85,47 g/mol), per il litio di 5,5 pg o 7,9,10-13 mol (Li: 6,94 g/mol). Dopo l'espressione eterologa di Na⁺,K⁺-ATPasi negli ovociti di Xenopus, si possono raggiungere correnti di pompa di 100 nA (che equivalgono a circa 6,2·1011 cariche elementari al secondo, o 1,03,10-12 mol ^s-1), risultando così in un trasporto di 6,10-6 C di carica entro 1 minuto. Poiché il trasporto di una carica netta corrisponde all'assorbimento di due ioni Rb⁺ (a causa della stechiometria 3Na⁺/2K⁺), una corrente di 100 nA per 1 min corrisponde a un assorbimento di 1,2·^10-10 mol Rb⁺. Pertanto, anche dopo una diluizione di 1.000 volte (omogeneizzazione di un ovocita con circa 1 μl di volume in 1 ml di acqua), un tipico campione di THGA-AAS (20 μl) contiene 2,4·^10-12 mol di Rb⁺ (o 204 pg), che è molto al di sopra della soglia di rilevamento. Pertanto, anche i trasportatori con un'attività di trasporto o un'espressione della membrana plasmatica più di 100 volte inferiori possono essere analizzati con la tecnica regolando opportunamente il tempo di flusso dell'esperimento.

Poiché la velocità di pompaggio dipende sensibilmente dalla temperatura (le energie di attivazione tipiche per Na⁺,K⁺-ATPasi sono comprese tra 90 kJ/mol e 130 kJ/mol^1-3, il che si traduce in un aumento di circa il 30% del tasso di turnover al passaggio da 20 °C a 22 °C), è obbligatorio eseguire le misurazioni del flusso sotto un controllo preciso della temperatura (aria condizionata) con soluzioni tampone ben bilanciate. Inoltre, gli ovociti devono essere accuratamente selezionati per quanto riguarda le dimensioni omogenee per l'espressione di un trasportatore ionico. Con queste precauzioni, è possibile ottenere regolarmente errori standard sperimentali inferiori al 10% con circa 10 celle per condizione sperimentale. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di determinare, ad esempio, le apparenti affinità Rb⁺ del trasporto cationico^4-6, l'influenza del pH extracellulare e intracellulare⁷ e l'effetto delle mutazioni dei residui coinvolti nella coordinazione cationica durante il trasporto^4,8. Un vantaggio della tecnica è che i flussi ionici possono essere determinati anche in combinazione con il bloccaggio della tensione a due elettrodi degli ovociti, che da un lato assicura un controllo accurato del potenziale di membrana durante il trasporto e dall'altro consente di correlare il flusso ionico con la corrente di membrana. Pertanto, è stato possibile verificare la stechiometria 3Na⁺/2K⁺ della Na⁺,K⁺-ATPasi (vedi risultati esemplificativi di seguito) e determinare la dipendenza dal voltaggio del trasporto cationico della H⁺/K⁺-ATPasi^{gastrica 7}.

Protocollo

1. Costrutti di cDNA ed espressione proteica in oociti di Xenopus

Il DNA complementare (cDNA) della proteina di membrana di interesse deve essere clonato in un vettore adatto all'espressione negli oociti di Xenopus laevis, come pTLN⁹ o pcDNA3.1X¹⁰. Questi vettori ottimizzati contengono le regioni non tradotte 5' e 3' (UTR) del gene β-globina di Xenopus laevis che delimitano il sito di clonaggio multiplo (MCS), una sequenza promotrice per la RNA polimerasi (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7) posizionata prima dell'UTR 5', una sequenza poli-A a valle del MCS per garantire la stabilità del cRNA nelle cellule e, ulteriormente a valle, un'altra serie di siti di restrizione per enzimi endonucleasi a taglio singolo, utilizzati per linearizzare il plasmide al fine di impiegarlo come stampo per la trascrizione in vitro del cRNA.

Per distinguere l'attività della proteina umana Na sovraespressa⁺/⁺-ATPasi (α₂-subunità+β₁-subunità) dalla Na endogena⁺/⁺-ATPasi degli oociti, le mutazioni Q116R e N127D sono state introdotte per ottenere una proteina resistente all'ouabaina con una IC50 nell'ordine dei millimoli¹¹. Nel caso di H⁺/⁺-ATPasi, le misurazioni del flusso sono state effettuate utilizzando l'H⁺/⁺-subunità α della -ATPasi mutante S806C, poiché Rb⁺ i flussi sono stati correlati ai dati cinetici ottenuti da esperimenti di fluorometria con blocco di tensione (VCF). La tecnica VCF (https://www.jove.com/video/2627/ esaminare la dinamica conformazionale delle proteine di membrana in situ mediante marcatura fluorescente specifica per sito)¹² si basa sull'attacco sito-specifico di un fluorocromo a un residuo di cisteina introdotto in posizione strategica, il quale segnala i cambiamenti conformazionali dell'enzima.

2. Linearizzazione e Purificazione del Template di DNA

1. Per la linearizzazione del DNA stampo, digerire 3 μg di DNA plasmidico in un volume di reazione di 50 μl con 5 μl di tampone 10x concentrato appropriato per l'enzima di restrizione e 10 U di enzima di restrizione per 1 ora a 37 °C.
2. Purificare il DNA linearizzato utilizzando il High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Aggiungere innanzitutto 350 μl di tampone di legame (contenente guanidinioisotiocianato) al vial della digestione. Dopo questo passaggio di purificazione, il DNA stampo linearizzato è di qualità 'RNA' poiché il guanidinioisotiocianato è un denaturante proteico efficiente e distrugge in particolare le RNasi, che sono contaminanti frequenti nei laboratori di biologia molecolare.
3. Inserire le colonne da centrifuga in provette di raccolta, applicare sulla colonna la soluzione di DNA ottenuta al passaggio 2, centrifugare a 13.000 x g per 30 secondi e scartare il flusso passante.
4. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio sulla colonna. Centrifugare per 1 minuto a 13.000 x g e scartare il flusso passante.
5. Aggiungere 200 μl di tampone di lavaggio sulla colonna. Centrifugare per 1 minuto a 13.000 x g per asciugare completamente la colonna.
6. Posizionare la colonna da centrifuga in una nuova provetta Eppendorf da 1,5 ml e aggiungere 50 μl di acqua priva di nucleasi (Ambion Prodotto n. AM9937) sulla colonna. Eluire centrifugando per 1 minuto alla velocità massima.
7. Dopo l'eluizione, concentrare la soluzione contenente il DNA a circa 15 μl. Questo passaggio garantisce che la soluzione contenga 0,5 μg di DNA linearizzato in 3 μl, concentrazione raccomandata per la successiva reazione di trascrizione in vitro di cRNA.

3. Sintesi di cRNA in vitro

1. Scegliere il kit mMessage mMachine appropriato (Ambion Prodotto n. 1340, n. 1344) in base alla sequenza del promotore sul plasmide (SP6, T7). In un volume totale di reazione di 10 μl, aggiungere 3 μl di DNA linearizzato ottenuto nel passaggio precedente e 1 μl di tampone per trascrizione a 5 μl di aliquote pre-dosate di miscela NTP-cap. La preparazione di aliquote della miscela NTP-cap è necessaria per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, che potrebbero causare la degradazione dei nucleoside trifosfati. Infine, aggiungere 1 μl della polimerasi RNA appropriata, mescolare brevemente e centrifugare leggermente il mix di reazione.
2. Incubare il mix di reazione per 1-2 ore a 37 °C. Il tempo di incubazione non deve superare le 2 ore, poiché ciò potrebbe ridurre il rendimento o la qualità del cRNA.
3. Aggiungere 15 μl di soluzione di LiCl 3 M ghiacciata proveniente dal kit, 15 μl di acqua priva di nucleasi fredda, mescolare brevemente (non vortexare), centrifugare brevemente il campione a 11.000 x g per 10 secondi e conservare a -20 °C per almeno 30 minuti per consentire la precipitazione del cRNA.
4. Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C e centrifugare per almeno 15 minuti a 13.000 x g dopo la precipitazione.
5. Rimuovere con attenzione e completamente il soprannatante dal pellet di colore marrone chiaro presente sul fondo della provetta e aggiungere 150 μl di etanolo al 70% di grado RNA, precedentemente raffreddato a -20 °C. Centrifugare a 4 °C per 5 minuti a 13.000 x g.
6. Rimuovere completamente il soprannatante, asciugare brevemente (1-2 minuti) il pellet residuo di cRNA in un evaporatore centrifugo (e.g. Eppendorf Concentrator modello 5301) a temperatura ambiente.
7. Risolvere il pellet in 12 μl di acqua fredda priva di nucleasi. ATTENZIONE: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti mantenendo il campione di cRNA in ghiaccio.
8. Determinare la concentrazione di cRNA mediante spettrofotometro (e.g. Eppendorf BioPhotometer).
9. Verificare l'integrità del cRNA mediante elettroforesi su gel di agarosio. ATTENZIONE: Questo controllo incrociato è necessario, poiché anche l'RNA parzialmente degradato produce un'assorbanza UV diversa da zero. Per l'elettroforesi del cRNA, utilizzare una camera di elettroforesi accuratamente pulita e riempita con tampone TAE fresco e un gel di agarosio al 1% appena preparato. Se si sospetta contaminazione da RNasi nella camera di elettroforesi o nel tampone, riempire la camera con 0,1 M di HCl per 1 ora per la pulizia e preparare il tampone TAE utilizzando acqua priva di nucleasi.
10. Conservare il cRNA a -20 °C fino all'uso. Il cRNA può essere conservato per almeno un anno a -20 °C.

4. Ottenimento del materiale ovarico da femmine di Xenopus laevis mediante ovariectomia parziale

Questo protocollo è stato approvato dall'autorità statale competente (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, The Senate of Berlin, Germany).

1. Non somministrare cibo alla rana almeno 12 ore prima dell'intervento chirurgico per prevenire il vomito.
2. Preparare una soluzione di 2 g di anestetico locale tricaina (MS-222) disciolti in 1 L di acqua, aggiustata a pH 7,0 con tampone HEPES 5 mM. ATTENZIONE: Indossare sempre guanti in nitrile durante la manipolazione dell'MS-222 e preparare la soluzione all'interno di una cappa chimica.
3. Immergere la rana nella soluzione di tricaina (massimo 10 minuti) fino a quando l'animale non presenta più riflessi di raddrizzamento. Per verificare l'incoscienza, provare a girare la rana sulla schiena con le mani e osservare la presenza di movimenti di difesa.
4. Togliere la rana manualmente dalla soluzione di tricaina e risciacquare l'animale con acqua corrente fredda per rimuovere l'anestetico.
5. Posizionare la rana con il dorso rivolto verso l'alto su un letto di ghiaccio coperto con un tovagliolo di carta bagnato, per evitare danni alla pelle della rana dovuti al contatto diretto con il ghiaccio. Mantenere la pelle dell'animale sempre umida durante l'intervento per prevenire l'essiccamento. Il posizionamento sul ghiaccio prolunga la durata dell'anestesia.
6. Eseguire un'incisione addominale di piccole dimensioni (lunghezza 8-10 mm) con forbici affilate su un lato o sull'altro della linea mediana della rana. ATTENZIONE: Prestare attenzione a non danneggiare la linea laterale. Gli interventi successivi devono essere effettuati su lati alterni per favorire una buona ripresa del tessuto ovarico sottostante. Solitamente, è necessario penetrare attraverso tre strati di tessuto (la pelle esterna, uno strato sottile di tessuto connettivo bianco – la fascia – e uno strato muscolare).
7. Dopo aver aperto l'addome, afferrare parti dei lobi ovarici con pinze smussate ed estrarle delicatamente all'esterno. Come indicazione, rimuovere circa 3-5 cm di tessuto ovarico mediante incisione. In caso di lesione di piccoli vasi sanguigni e sanguinamento, applicare pressione con una bacchetta di plastica sterile o raffreddare la lesione con ghiaccio fino a quando il sanguinamento non si arresta.
8. Chiudere chirurgicamente l'incisione utilizzando un punto separato con sutura Ethicon Vicryl 4.0 (Johnson & Johnson #V633H). Usare strumenti chirurgici per la sutura e annodare due o tre nodi in punti distinti lungo l'incisione. ATTENZIONE: È fondamentale che ogni nodo suturi i tre strati di tessuto in un unico passaggio.
9. Dopo l'intervento, posizionare la rana in un bacile d'acqua leggermente inclinato (30 L), contenente una quantità d'acqua sufficiente a coprirne il fondo, in modo che le narici dell'animale rimangano al di sopra del livello dell'acqua per consentire la respirazione. Coprire l'animale durante il periodo di risveglio (circa 1-2 ore) con un tovagliolo di carta bagnato per evitare l'essiccamento della pelle sensibile.
10. Quando l'animale riprende attività, riempire completamente il bacile d'acqua e mantenere la rana separata dagli altri animali per 3-4 giorni per monitorarne il recupero e la guarigione della ferita.
11. Dopo l'intervento, evitare ulteriori operazioni sulla stessa rana per almeno 3 mesi, per consentire un completo recupero dell'animale e del suo tessuto ovarico. Come indicazione, su ciascuna rana possono essere eseguiti al massimo 6-8 interventi.

5. Isolamento enzimatico di ovociti singoli

1. Tagliare il materiale ovarico in pezzi più piccoli con le forbici e trasferire il tessuto in Soluzione Ringer per ovociti senza Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂)₂, 5 mM HEPES, pH 7,4) contenente collagenasi (20 mg/ml, tipo 1A da Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) e inibitore della tripsina (10 mg/ml, Tipo III-O da albume d'uovo di pollo, Sigma #T2011).
2. Agitare delicatamente la soluzione di digestione per 2,5 ore a 18 °CSuccessivamente, seguire l'andamento della digestione a intervalli di 15 minuti fino a quando la maggior parte degli oociti si sarà separata dal tessuto follicolare.
3. Lavare gli oociti più volte in un tubo Falcon da 50 ml con Soluzione Ringer per ovociti senza Ca²⁺ finché la soluzione non è sufficientemente priva di detriti tissutali.
4. Conservare gli oociti in Soluzione Ringer per ovociti contenente Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂)₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH 7,4) contenente gentamicina (50 μg/ml) a 18 °C.

6. Iniezione di cRNA

1. Per l'espressione della Na⁺,K⁺- o H⁺,K⁺-ATPasi, iniettare gli oociti con 50 nl di soluzione di cRNA contenente 25 ng di cRNA della subunità α e 5 ng di cRNA della subunità β, utilizzando una pompa di iniezione elettrica Nanoject II (Drummond Scientific Inc.), con tubi ematocrito da 3,5" (Drummond #3 000-203-G/X). ATTENZIONE: La quantità di mRNA può variare a seconda della proteina bersaglio e potrebbe essere necessario ottimizzarla per ottenere un'espressione massimale mediante immunoblotting.
2. Per ogni condizione di flusso (ad es. a una specifica concentrazione di Rb⁺), iniettare 18-22 oociti. Di questi, il 50% verrà sottoposto a saggio in condizioni "+flusso" (ad es. una certa concentrazione di Rb⁺), e il 50% in condizioni "-flusso" (ad es. con la concentrazione scelta di Rb⁺ e un inibitore specifico dell'enzima a concentrazione saturante, come 10 mM ouabaina per la Na⁺,K⁺-ATPasi o 10 μM SCH28080 a pH 5,5 per la H⁺,K⁺-ATPasi).
3. Dopo l'iniezione, trasferire gli oociti separatamente in piastre a 96 pozzetti riempite a metà con Soluzione di Ringer per Oociti contenente Ca²⁺ e 50 μg/ml di gentamicina, a 18 °C.
4. Coprire la piastra a 96 pozzetti con Parafilm per evitare un'eccessiva evaporazione.
5. Incubare gli oociti per 2-7 giorni (a seconda della proteina di interesse) a 18 °C. Se è necessario conservare gli oociti per più di 3 giorni, si raccomanda di sostituire il mezzo di incubazione nei singoli pozzetti ogni 3 giorni.
6. Per ogni serie di dati di flusso (ad es. un esperimento di titolazione della [Rb⁺]), circa 10 oociti non iniettati (o iniettati con 50 nl di acqua priva di nucleasi) devono essere sottoposti a saggio in condizioni "+flusso" e "-flusso". Incubare quindi un numero sufficiente di cellule controllo nello stesso modo degli oociti iniettati con cRNA prima dell'analisi del flusso.

Pretattamento di oociti esprimenti ATPasi eterologa

Procedura di carico di Na⁺

Per effettuare misurazioni funzionali della Na⁺/K⁺-ATPasi, è importante aumentare la concentrazione intracellulare di Na⁺¹³, come segue:

1. Trasferire gli oociti nel Na⁺ Loading Buffer (110 mM NaCl, 2,5 mM Na-citrato, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) per 45 min a ghiaccio.
2. Per il successivo recupero, incubare gli oociti nel Post Loading Buffer "PLB" (100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM BaCl₂, 5 mM NiCl₂ e 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) per almeno 30 min a ghiaccio.
3. Conservare gli oociti nel PLB a ghiaccio fino all'uso.

7. Pre-blocco della Na⁺,K⁺-ATPasi endogena

ATTENZIONE: Poiché gli oociti di Xenopus esprimono una Na⁺,K⁺-ATPasi endogena, è fondamentale bloccare questa pompa endogena prima di eseguire esperimenti di flusso di Rb⁺, come segue:

1. Ora bloccare la Na⁺,K⁺-ATPasi endogena incubando gli oociti nel Post Loading Buffer contenente 100 μM di ouabaina per 15 min a temperatura ambiente.

8. Elettrofisiologia

1. Preparare microelettrodi tirando capillari di borosilicato (GB150F-8P, Science Products GmbH) mediante un micropipettatore a due stadi (Modello PC-10, Narishige).
2. Riempire gli elettrodi di vetro dalla parte posteriore con KCl 3 M. Per esperimenti TEVC con H⁺,K⁺-ATPasi, si raccomanda di utilizzare NaCl 3 M invece del KCl, il che ha portato a registrazioni di corrente più stabili. Montare la pipetta sopra il filo Ag/AgCl dei supporti per microelettrodi del sistema a doppio elettrodo per il voltage-clamp.
3. Inserire i microelettrodi di vetro e due ponti di agar (questi devono essere preparati con NaCl/agar invece del comune KCl/agar), che collegano gli elettrodi di riferimento Ag/AgCl alla soluzione del bagno, nella camera di registrazione (Warner Instr., modello RC-10) precedentemente riempita con tampone di misura (e.g. PLB con ouabaina 10 μM per Na⁺,K⁺-ATPasi).
4. Portare l'amplificatore per voltage-clamp (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Germania) in modalità "OFF".
5. Verificare separatamente la resistenza di ciascun elettrodo di vetro (entrambi dovrebbero avere valori compresi tra 0,5-2 MΩ).
6. Controllare i potenziali di offset degli elettrodi di tensione e di corrente sul display appropriato dell'amplificatore TEVC. In caso di scostamento da zero, regolare l'offset mediante i regolatori di offset corrispondenti sull'amplificatore.
7. Posizionare un'ovocita al centro della camera e penetrare delicatamente la membrana con l'elettrodo di corrente e quello di tensione.
8. Verificare la lettura del potenziale sull'amplificatore. Il valore letto per il potenziale dell'elettrodo di tensione rappresenta ora il potenziale di riposo della cellula.
9. Portare l'amplificatore in modalità VC (voltage-clamp).
10. Utilizzando il software pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA), fissare la cellula a un potenziale di membrana predefinito. Questo può essere il valore del potenziale di riposo precedentemente misurato (per la registrazione in condizioni di corrente di membrana nulla) oppure qualsiasi valore di potenziale di prova desiderato. Prestare attenzione all'ampiezza e alla stabilità della corrente di perdita (in assenza di K⁺/Rb⁺/Li⁺), che, come indicazione generale, non dovrebbe superare -200 nA a -30 mV.
11. Perfondere l'ovocita per un certo tempo (e.g. 3 min per Na⁺,K⁺-ATPasi) con soluzione contenente Rb⁺ (per ottenere corrente massima, utilizzare concentrazioni di saturazione determinate mediante misure di flusso in condizioni non clamped) e registrare la corrente della pompa con il software pCLAMP in modalità di registrazione continua. Assicurarsi che l'assorbimento di Rb⁺ sia completamente interrotto successivamente perfondendo la cellula con soluzione priva di Rb⁺ per 30 secondi.
    1. Interrompere l'esperimento di voltage-clamp a due elettrodi, rimuovere l'ovocita dalla camera di registrazione e procedere al passaggio 4 di lavaggio del paragrafo "Esperimenti di assorbimento di Rb⁺" per analizzare l'assorbimento di Rb⁺ mediante spettrofotometria di assorbimento atomico.
12. Eseguire la sottrazione della corrente di offset e valutare l'integrale temporale della corrente della pompa utilizzando il programma Clampfit del pacchetto pCLAMP.

9. Misurazioni dell'assorbimento di Rb⁺

1. Tagliare e sciogliere la punta gialla di una pipetta da 200 μl fino a un diametro di circa 2 mm. L'uso di queste punte garantisce un trasferimento minimo di soluzione quando gli oociti vengono spostati tra piatti di incubazione o di lavaggio. Sciogliere brevemente la punta con la fiamma di un accendino tascabile. Questo passaggio di lucidatura previene il danneggiamento degli oociti.
2. Preparare per ogni oocita da misurare un tubo Eppendorf da 1,5 ml riempito con 1 ml di acqua Millipore. Disporre tre piastre di Petri contenenti tampone di lavaggio privo di Rb⁺ (es. PLB) e una con acqua Millipore.
3. Trasferire contemporaneamente cinque oociti preincubati in una piastra di Petri da 3,5 cm contenente tampone per il flusso di Rb⁺ (concentrazioni da 0 a 15 mM di Rb⁺) e incubare per 3 min (Na⁺,K⁺-ATPasi) o 15 min (H⁺,K⁺-ATPasi) sotto controllo termico (es. 21 °C in una stanza climatizzata o su una piastra riscaldante).
4. Trasferire contemporaneamente gli oociti nella prima piastra contenente tampone di lavaggio privo di Rb⁺ (nel caso della Na⁺,K⁺-ATPasi si può usare PLB). È obbligatorio mantenere le deviazioni tra i tempi di incubazione inferiori a 5 sec. Lavare delicatamente.
5. Spostare gli oociti nella seconda e nella terza piastra contenente tampone di lavaggio privo di Rb⁺, risciacquare delicatamente.
6. Trasferire gli oociti nella piastra contenente acqua Millipore, risciacquare delicatamente.
7. Trasferire ogni oocita singolarmente in uno dei tubi Eppendorf preparati contenenti 1 ml di acqua Millipore.
8. Omogeneizzare l'oocita aspirando e dispensando con una punta da 200 μl fino a quando la soluzione appare omogeneamente torbida.

10. Preparazione dell'Analyst 800 utilizzando il sistema di fornace THGA

1. Accendere la valvola del gas inerte richiesto (argon) e inserire una lampada a catodo cavo appropriata (lampade a catodo cavo monoelemento per Li⁺ o Rb⁺; Photron, Melbourne, Australia) in una posizione arbitraria della presa.
2. Avviare il software di controllo WinLab32 (Perkin Elmer) e accendere la lampada a catodo cavo appropriata. Le lampade a catodo cavo Perkin Elmer Lumina vengono riconosciute automaticamente e appaiono nell'elenco di selezione. Le lampade a catodo cavo non compatibili devono essere inserite manualmente.
3. Attendere un tempo di riscaldamento di circa 10-15 minuti per consentire l'equilibrazione delle lampade.
4. Verificare visivamente che il tubo THGA (tubo atomizzatore al grafite riscaldato trasversalmente, Perkin Elmer, #B3000641) sia in buone condizioni. I forni THGA dovrebbero essere sostituiti ogni 300 analisi (vita media dichiarata dal produttore), ma possono resistere a un numero maggiore di campioni.
5. Selezionare la tecnica "forno THGA" in WinLab32.
6. Preparare almeno cinque campioni di calibrazione con concentrazioni di Rb⁺/Li⁺ comprese tra 10 e 50 μg/L (e.g. mediante opportuna diluizione da una soluzione 1 M di RbCl o LiCl) e un campione bianco contenente solo acqua Millipore. Nota: i sali devono essere della massima purezza disponibile ("puriss." o da standard di calibrazione commerciali per finalità di AAS).
7. Scegliere il file di inizializzazione appropriato (denominato file "metodo", che fornisce un riferimento ai parametri di calibrazione e carica le impostazioni dello strumento, e.g. la lunghezza d'onda di rilevamento per AAS; le lunghezze d'onda per Rb⁺ e Li⁺ sono rispettivamente 780 nm e 670,8 nm), quindi inserire le posizioni e le concentrazioni dei campioni di calibrazione. A tale scopo, selezionare l'autocampionatore appropriato (piatto campioni con 88 o 148 posizioni di campionamento per lo strumento AAnalyst 800).
8. Misurare la curva di calibrazione.
9. Trasferire ora ciascun omogeneato di oocita in singole provette in polipropilene da 1,2 ml (Perkin Elmer, #B0510397) e posizionare queste provette nel piatto dell'autocampionatore.
10. Creare un file di informazioni sui campioni per identificare i campioni nelle posizioni dell'autocampionatore, quindi regolare il volume del campione a 20 μl e avviare lo strumento.
11. Al termine dell'analisi (o durante un controllo visivo ogni ora per serie lunghe di campioni), verificare la presenza di campioni in cui la quantità misurata di Rb⁺ supera il valore massimo della curva di calibrazione. In tal caso, diluire opportunamente i campioni interessati e ripetere la misurazione.

11. Osservazioni per la misurazione di un elevato numero di campioni (superiore a 50)

• Per un'esecuzione notturna dello strumento, si consiglia di riempire il serbatoio dell'autocampionatore con acqua Millipore per prevenire l'evaporazione degli omogeneati nei tubi di prova.
• Si raccomanda di posizionare tra ogni gruppo di 20 campioni un tubo di prova contenente HNO₃ al 2% per evitare l'occlusione della capillare di iniezione dell'autocampionatore.

Protocollo di temperatura consigliato per THGA-AAS per il rubidio

Passo	Temperatura (°C)	Tempo di rampa (sec)	Tempo di mantenimento (sec)	Portata di gas argon (ml/min)
Essiccazione 1	110	1	20	250
Essiccazione 2	130	5	30	250
Pirodissociazione	300-600	10	20	250
Atomizzazione	1700-1800	0	5	0
Pulizia	2400	1	2	250

Protocollo raccomandato di temperatura THGA-AAS per il litio

Passaggio	Temperatura (°C)	Tempo di salita (sec)	Tempo di mantenimento (sec)	Portata del gas argon (ml/min)
Essiccazione 1	110	1	30	250
Essiccazione 2	130	15	30	250
Piroli	900	10	20	250
Atomizzazione	2200	0	5	0
Pulizia	2450	1	3	250

Analisi dei dati

1. Per ogni condizione di misurazione, calcolare l'assorbimento medio di Rb⁺. Lo spettrofotometro AAS fornisce valori in μg/L, che devono essere convertiti in pmol/oocita/min.
2. Per le analisi cinetiche (valori KM apparenti), sottrarre l'assorbimento di Rb⁺ di fondo determinato negli oociti di controllo non iniettati dello stesso lotto alla data concentrazione di RbCl.
3. Tracciare il grafico con il software Origin e applicare un adattamento secondo la funzione di Hill o secondo la funzione di Michaelis-Menten ai dati. In queste equazioni, [S] indica la concentrazione del substrato, nH il coefficiente di Hill e K_0.5 la concentrazione del substrato necessaria per un'attivazione al 50% del massimo.

Risultati

La quantificazione dell'assorbimento di Rb⁺ mediato da ATPasi di tipo P che trasportano K⁺ (o Rb⁺) tramite controcircolo, mediante spettroscopia di assorbimento atomico (AAS) nel sistema di espressione dell'oocita di Xenopus, permette la determinazione affidabile dei parametri cinetici enzimatici.

Determinazione della stechiometria del trasporto della Na⁺/K⁺-ATPasi

Per la Na⁺/K⁺-ATPas...

Discussione

Il metodo descritto per misurare la quantità di Rb⁺ (o Li⁺) assorbita nei singoli ovociti di Xenopus che esprimono Na⁺,K⁺- o H⁺,K⁺-ATPasi si è dimostrata una tecnica versatile, flessibile e accurata per determinare i parametri cinetici o termodinamici di trasporto per ATPasi di tipo P che controtrasportano cationi^1,4,5,7,8. Si tratta di un'alternativa sicura e affidabile ai saggi di flusso di traccianti radioattivi e consente di affront...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale di sutura 4.0 Ethicon Vicryl	Johnson	Johnson V633H
Collagenasi tipo 1A da Clostridium hystolyticum	Sigma Aldrich	C9891
Kit di purificazione del prodotto PCR ad alta purezza	Roche Applied Science	11732676001
Acqua priva di nucleasi	Ambion	AM9937
mMessaggio mMachine Kit SP6/ T7	Ambion	1340, 1344
Ouabain ottaidrato	Sigma Aldrich	O3125
Tricaina (sale etilico 3-amminobenzoato metanosulfonato)	Sigma Aldrich	A5040
Inibitore della tripsina di tipo III-O da albume d'uovo di gallina	Sigma Aldrich	T2011
SCH28080	Sigma Aldrich	S4443
AAnalyst 800	Perkin Elmer	0993-5256
WinLab32TM	Perkin Elmer
Biofotometro	Eppendorf	6131 000.012
Capillari borosilicati	Prodotti scientifici	GB150F-8P
Provette per ematocrito 3.5"	Drummond Scientific	3 000-203-G/X
Lampada a catodo cavo	Litio Photron	P929LL
Lampada a catodo cavo Rubidio	Photron	P945
Estrattore per micropipette	Narishige	Modello PC-10
Camera di registrazione degli ovociti RC-10	Warner Instr.	W4 64-0306
Pompa di iniezione Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
software pCLAMP	Molecular Devices
Tazza per campioni in polipropilene (1,2 ml)	Perkin Elmer	B0510397
Speedvac - Concentratore modello 5301	Eppendorf	5301 000.210
THGA Tubo	Perkin Elmer	B3000641
Turbo TEC-10CX Amplificatore	NPI Electronics	TEC-10CX