Articolo metodologico

Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

DOI:

10.3791/50227

⸱

21 giugno 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington

In questo articolo

Sommario

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Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Abstract

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La ricostituzione dei canali ionici in membrane lipidiche chimicamente definite per registrazione elettrofisiologica è una tecnica potente a individuare e studiare la funzione di queste proteine ​​importanti. Tuttavia, le preparazioni classiche, come doppi strati planari, limitano le manipolazioni ed esperimenti che possono essere eseguite sul canale ricostituito e il suo ambiente di membrana. La struttura più alveolare dei liposomi giganti permette esperimenti di patch-clamp tradizionali senza sacrificare controllo dell'ambiente lipidico.

Electroformation è un mezzo efficace per produrre liposomi giganti> 10 micron di diametro, che si basa sull'applicazione della tensione alternata ad un sottile film lipidico, ordinata depositato su una superficie dell'elettrodo. Tuttavia, poiché il protocollo classico prevede i lipidi da depositare da solventi organici, non è compatibile con meno robusti proteine ​​di membrana come canali ionici e deve essere modificata. Recentemente, protocols sono stati sviluppati per electroform liposomi giganti da parzialmente disidratati piccoli liposomi, che si sono adattati a liposomi contenenti proteine ​​nel nostro laboratorio.

Presentiamo qui lo sfondo, le attrezzature, le tecniche, e le insidie ​​di electroformation di liposomi giganti da piccole dispersioni liposomi. Cominciamo con il protocollo classico, che dovrebbe essere masterizzato prima di tentare i protocolli più impegnativi che seguono. Dimostriamo il processo di disidratazione parziale controllata di piccoli liposomi con equilibrio vapore con soluzioni saline sature. Infine, abbiamo dimostrato il processo di electroformation stesso. Noi descriveremo semplice attrezzatura, poco costoso che può essere fatto in casa per la produzione di liposomi di alta qualità, e descrivere l'ispezione visiva della preparazione in ogni fase per garantire i migliori risultati.

Introduzione

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Liposomi giganti (spesso chiamati vescicole unilamellari giganti, o GUVs) sono stati principalmente utilizzati per lo studio della fisica e della chimica fisica di doppi strati lipidici, inclusi studi di deformazione doppio strato, la coesistenza di fase laterale ("zattere"), la fusione di membrana, ecc 1-4. Hanno una cella grossolanamente struttura simile: guscio sferico di membrana che circonda un interno acquosa che può essere facilmente reso diverso rispetto al tampone acquoso circostante. Essi sono, per definizione, ≈ 1-100 micron di diametro, in modo che possano essere esposte utilizzando una varietà di approcci di microscopia ottica. Posson....

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Protocollo

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1. Deposizione di lipidi da solventi organici: Protocollo Classica

  1. Rimuovere i lipidi dalla conservazione a -20 ° C o -80 ° C; caldo per RT. Attenzione: i lipidi sono estremamente igroscopico, e molti sono sensibili all'ossigeno. Coprire lipidi nella secca Argon o Azoto e in tutte le fasi minimizzare l'esposizione all'aria.
  2. Se necessario, sospendere i lipidi in cloroformio o cicloesano a mg / ml 1-10; notare che le concentrazioni indicate dal costruttore sono in genere solo nominale ATTENZIONE: Indossare guanti ed altri dispositivi di protezione individuale appropriati quando si utilizzano solventi organi....

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Risultati

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Nei nostri esempi, preparando liposomi da una miscela di circa 55% molare POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphoserine , 30 mol% colesterolo, e 0.1 mol% Texas Red-etichettato 1,2-dipalmitoil-sn-phosphoethanolamine (TxR-PDPE). Questa composizione è stata scelta da circa rappresentante della radice dorsale lipidi gangliari 18. Prendiamo atto che il 15% molare addebitato lipidi (qui POPS) è vicina al limite di ciò ch.......

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Discussione

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Electroformation di liposomi giganti si è sviluppato in una tecnica flessibile, compatibile con diversi lipidi, preparati, e buffer. Attento controllo del processo di deposizione lipidica è più critico per il successo. Abbiamo presentato strumenti semplici per rendere deposizione controllata di lipidi da piccole preparazioni liposomiali un processo semplice. L'umidità relativa è critica per la disidratazione dei liposomi iniziali, e il valore ottimale varia con la concentrazione iniziale di soluti nella sospensione .......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Bryan Venema e Eric Martinson per costruire l'apparato electroformation. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of General Medical Sciences del National Institutes of Health (R01GM100718 a SEG) e il National Eye Institute del National Institutes of Health (R01EY017564 a SEG).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Multimetro digitaleAgilent Technologies, www.agilent.comU1232A o simileQualsiasi multimetro andrà bene, ma evita gli ohmmetri analogici vecchio stile che applicano molta più corrente alla resistenza in prova.
Fluke117 o 177Qualsiasi multimetro andrà bene, ma evita gli ohmmetri analogici vecchio stile che applicano molta più corrente alla resistenza in prova.
Generatore di funzioniAgilent Technologies, www.agilent.com33210A o simileLa maggior parte dei generatori di funzioni funziona per protocolli semplici. Questo modello programmabile è utile per protocolli avanzati di elettroformazione. Assicurati che il generatore sia in grado di pilotare 10 V picco-picco in un 50 Ω caricare
i vetrini rivestiti ITODelta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.comCB-90IN-S107 o similiRompili a metà per fare due vetrini, 25 mm x 37 mm
Regolatore di temperaturaOmega Engineering Stamford, CT www.omega.com CNi3233 o simile
IgrometroExtech, Nashua, NH, www.extech.com445815
Foglio di gomma siliconicaMcMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com87315K64Usa il silicone USP Grado VI per la sua guarnizione EMI ad alta purezza
Laird Technologies www.lairdtech.com4202-PA-51H-01800 o simileDistribuito da Mouser www.mouser.com
TxR-DHPELife Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.comT1395MPSono disponibili altri lipidi marcati in fluorescenza, ma TxR-DHPE è uno dei più luminosi e fotostabili.
POPCAvanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com850457P o 850457CI lipidi possono essere ordinati come polveri (P) o in cloroformio (C)
POPSAvanti Polar Lipids840034P/C
ColesteroloSigma-AldrichC8667

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  2. Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000....

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Tecnica di elettroformazionedeposizione di film lipidicodisidratazione controllatavetro rivestito di ITOvescicole unilamellari gigantiimaging di liposomiricostituzione di proteine di membranaregistrazione elettrofisiologica

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